凝结芽孢杆菌（Heyndrickxia coagulans）作为可食用益生菌，其安全性评价需要从基因型到表型形成完整证据链。本研究以健康婴儿粪便中分离的 BC99 菌株为对象，先通过 MGI G99 与 PacBio Sequel II 平台完成全基因组测序，再结合 VFDB、CARD、GO、KEGG 等数据库注释，筛查毒力与耐药基因、分析次级代谢基因簇；随后依次开展溶血、细胞毒性、抗生素敏感性、模拟胃肠液耐受和细胞黏附等体外实验，最后通过小鼠急性经口毒性实验和大鼠 28 天亚急性经口毒性实验，结合血液学、凝血与生化指标，确立未观察到有害作用的剂量水平（NOAEL）。整个流程体现了基因组预测与表型验证相结合的安全评价策略。
对实验人员来说，该研究提供了益生菌安全评价的经典路线：先由全基因组测序给出遗传背景与潜在风险线索，再由体外实验快速筛查表型，最后用体内实验确认安全性。每一环节的数据环环相扣，共同支撑 BC99 可作为功能性食品和药品原料的结论。本文按实验环节梳理所用仪器与技术，并给出可借鉴的仪器组合方案。
文章分类
临床转化
标签：全基因组测序｜生物信息学分析｜体外安全实验｜体内毒性实验｜凝结芽孢杆菌
正文
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 菌株培养与形态观察 | 光学显微镜（Olympus CX33） | 确认菌株纯度和基本形态特征 | 菌落形态、革兰氏染色结果、细胞尺寸 |
| 全基因组测序 | MGI G99 平台（短读长）、PacBio Sequel II 平台（长读长） | 获得完整基因组序列，用于后续基因功能与安全性分析 | 基因组大小、GC 含量、基因数量、质粒有无等基因组特征 |
| 基因组组装与注释 | Unicycler、Bakta、MGAP、fastp 等软件 | 组装高质量基因组并预测基因功能 | 基因注释结果（CDS、rRNA、tRNA 等） |
| 毒力与耐药基因筛查 | VFDB、VirulenceFinder、CARD（RGI 软件）等数据库 | 评估菌株是否携带毒力或耐药基因 | 潜在毒力相关基因列表、耐药基因缺失数据 |
| 功能注释与代谢通路分析 | GO、KEGG 数据库 | 理解菌株的代谢能力与潜在功能 | GO 功能分类、KEGG 代谢通路富集结果 |
| 次级代谢基因簇分析 | antiSMASH 7.1.0、BAGEL 网络服务 | 鉴定可能产生抗菌活性物质的基因簇 | T3PKS、RiPP-like、fengycin、circularin_A、amylocyclicin 等基因簇位置与相似度 |
| 溶血实验 | Columbia 血琼脂平板 | 检测菌株是否具有溶血活性 | 溶血环的有无及类型 |
| 细胞毒性实验 | HT-29 细胞系、CytoTox 96® 非放射性细胞毒性检测试剂盒、酶标仪 | 评估菌株对肠道上皮细胞是否具有毒性 | LDH 释放量、细胞活力百分比 |
| 细胞黏附实验 | HT-29 细胞系、平板计数法 | 评估菌株在肠道上皮的定植潜力 | 每 100 个 HT-29 细胞黏附的细菌数 |
| 抗生素敏感性实验 | 纸片扩散法 | 检测菌株对抗生素的敏感性，评估耐药基因转移风险 | 最小抑菌浓度（MIC）值、敏感/中介/耐药判定 |
| 模拟胃肠液耐受实验 | 模拟胃液、模拟肠液、胆汁盐培养基 | 评估菌株在胃肠道环境中的存活能力 | 不同 pH、胆汁盐条件下的存活率 |
| 急性经口毒性实验 | SPF 级 ICR 小鼠、灌胃给药 | 初步评估单次大剂量给药的毒性 | 死亡情况、体重变化、大体病理检查结果 |
| 亚急性经口毒性实验 | SPF 级 SD 大鼠、灌胃给药、血液学/生化分析仪（如 CS-480） | 评估 28 天重复给药的毒性反应，确定 NOAEL | 体重、脏器重量、血液学参数、凝血参数、血清生化指标 |
1. 菌株形态观察
实验首先要确认菌株的纯度和基本形态。BC99 经培养后，在显微镜下呈革兰氏阳性短杆状，大小约 0.4～0.6 μm × 1.5～4.0 μm，常单在或成对排列；菌落为淡黄色、圆形、不透明。光学显微镜在这一步用于确认菌株的纯培养状态，为后续测序和功能实验提供合格的起步材料。若菌株不纯，后续所有基因组和表型数据都会失真。
2. 全基因组测序
细菌安全性评价的第一步是获得完整基因组序列。BC99 使用 MGI G99 平台产出短读长序列，用 PacBio Sequel II 平台产出长读长序列。短读长测序通量高、成本低，适合大规模碱基判定；长读长测序则能跨越重复区域，帮助组装出完整的环状染色体。两者结合，最终得到 3,655,496 bp 的单条环状染色体，GC 含量 46.23%，且未检测到质粒。基因组序列提交至 NCBI（登录号 CP092692.1），为后续所有分析提供基础。对实验人员来说，短读长加长读长的混合组装策略，是获得高质量细菌完成图的常用做法，尤其适合含有重复序列或质粒的样本。
3. 基因组组装与注释
获得测序数据后，需要用软件把短读长和长读长数据拼接成完整基因组。Unicycler 专门用于混合组装，可以结合两种数据的优势；fastp 负责质控，过滤低质量碱基和短序列。Bakta 和 MGAP 用于基因预测和注释，最终识别出 3,466 个基因，其中 3,357 个编码序列（CDS），3,273 个编码蛋白质。rnammer 则用于提取 16S rRNA 序列，通过与参考菌株 ATCC 7050 比对（相似度 99.06%，超过 97% 的阈值），确认 BC99 属于 Heyndrickxia coagulans 物种。这一步的核心是获得准确的基因功能注释，否则后续的毒力、耐药和代谢分析无从谈起。
4. 毒力与耐药基因筛查
安全性评价的关键问题之一是菌株是否携带可转移的毒力或耐药基因。研究者将基因组序列与 VFDB、VirulenceFinder、CARD 等数据库比对。结果显示，BC99 未检出已知耐药基因；以相似度 70% 和覆盖度 70% 为阈值，筛选出 7 个可能和毒力相关的基因：gnd、clpP、clpC、tufA、groEL、bpsC、bpsD。但后续讨论指出，这些基因多数与细菌生存、应激反应、代谢调控有关，例如 gnd 参与磷酸戊糖途径，clpP/clpC 负责蛋白质质量控制，groEL 参与蛋白质折叠，并非直接致病因子。这一结果说明，基因组筛查的价值在于发现潜在风险，但需要结合基因功能和表型实验判断其实际危害。
5. 功能注释与代谢通路分析
GO 和 KEGG 注释提供了基因功能的整体视图。GO 注释显示，BC99 的基因多参与生物调控和代谢过程，分子功能集中在结合和催化活性；KEGG 注释则显示，基因数最多的通路涉及氨基酸合成，以及 ABC 转运蛋白、双组分系统、磷酸转移酶系统、群体感应和鞭毛组装等。这些通路与菌株在肠道环境中的存活、营养摄取和定植能力相关。ABC 转运系统能高效转运营养物质和代谢产物，鞭毛组装基因可能增强运动性和定植能力，群体感应则参与菌群间的交流。此类功能注释有助于解释菌株的益生特性，但属于间接证据，仍需表型实验验证。
6. 次级代谢基因簇分析
益生菌产生的抗菌肽（细菌素）是抑制病原菌、调节肠道菌群的重要武器。研究者用 antiSMASH 7.1.0 和 BAGEL 两个网络工具分析基因簇。antiSMASH 检测到 T3PKS 和两个 RiPP-like 基因簇，其中一个与 amylocyclicin 有 50% 相似度；还检测到非核糖体肽 fengycin。BAGEL 进一步确认了两个环肽基因簇：circularin_A 和 amylocyclicin。这些基因簇的存在提示 BC99 可能产生抗菌活性物质，但基因存在并不等于表达。若要确认实际产出，还需要进行培养条件下的产物鉴定，本研究未涉及这一步。
7. 溶血实验
溶血性是益生菌安全评价的基本指标之一。BC99 在 Columbia 血琼脂平板上培养 48 h 后，未见溶血环，溶血反应阴性。这一结果是最直观的表型证据，说明菌株不产生破坏红细胞的溶血素。溶血实验操作简单、读数直接，是体外安全筛查的第一道防线。若出现 β 溶血，菌株的安全性就会受到严重质疑，通常会被直接淘汰。
8. 细胞毒性实验
细胞毒性实验用于评估菌株对肠道上皮细胞是否具有潜在的损伤作用。研究者将 HT-29 细胞与不同浓度（107、108、109 CFU/mL）的 BC99 悬液共培养 4 h 和 8 h，用 CytoTox 96® 试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）的释放量，并以最大释放组的 OD490 为参照计算细胞活力。结果显示，除 107 CFU/mL 处理 8 h 时细胞活力为 100% 外，其余条件下细胞活力均大于 100%，表明 BC99 对 HT-29 细胞无明显毒性。LDH 释放法是细胞毒性检测的通用方法，酶标仪在此用于准确读取 OD490 值。这一数据说明 BC99 与肠道上皮细胞接触时不会造成细胞膜损伤，是体外安全评价的重要证据。
9. 细胞黏附实验
益生菌要在肠道内发挥功能，必须先成功定植，而黏附是定植的第一步。研究者将 BC99 与 HT-29 细胞共培养 3 h，洗去未黏附的细菌后用 Triton X-100 裂解细胞，再通过平板计数法计算黏附细菌数。结果显示，每 100 个 HT-29 细胞平均黏附 40 ± 11 个 BC99 菌落形成单位（CFU），体现出较强的黏附能力。黏附实验将细菌数换算成直观的“每 100 个细胞的 CFU”，便于横向比较不同菌株的定植潜力。需要注意的是，体外黏附实验不能完全模拟体内复杂的肠道环境，其结果需要结合体内定植数据来看。
10. 抗生素敏感性实验
益生菌对抗生素的敏感性是安全性评价中的核心指标之一。若菌株携带可转移的耐药基因，其耐药性可能传递给肠道病原菌，造成公共卫生风险。研究者采用标准的纸片扩散法，检测 BC99 对庆大霉素、氨苄西林、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、红霉素、亚胺培南、四环素、复方磺胺甲噁唑、利福平、万古霉素等抗生素的敏感性。结果显示，BC99 对所有测试抗生素均敏感，MIC 值全部低于 2 μg/mL。这说明 BC99 不存在耐药性扩散的隐患，也间接支持其安全性。对实验人员而言，纸片扩散法成本低、操作简便，适合初筛；若要获得精确的 MIC 值，可再使用肉汤微量稀释法或商品化 MIC 检测条。
11. 模拟胃肠液耐受实验
口服益生菌必须能活着通过胃酸和胆汁环境，才能到达肠道发挥作用。研究者将 BC99 置于 pH 2.5、3.0、3.5 的 MRS 培养基和模拟胃液中，以及模拟肠液和含 0.1% 胆汁盐的培养基中，37℃ 处理 2 h 后进行平板计数，计算存活率。结果显示，BC99 在所有条件下的存活率均超过 90%，在 pH 2.5 的 MRS 中为 97.45%，在 0.1% 胆汁盐条件下为 92.85%。这些数据直接量化了菌株在胃肠道应激下的存活能力，是益生菌功能评价中必不可少的一环。模拟胃肠液实验条件标准化程度高，适合作为菌株筛选的常规手段。
12. 急性经口毒性实验
体外实验提供了大量安全信号，但最终的安全性结论需要体内数据支持。急性经口毒性实验是第一步，目的是评估单次大剂量给药是否会引起急性毒性反应。研究者给 ICR 小鼠灌胃 2 × 1010 CFU/kg 的 BC99 悬液，连续观察 14 天。结果显示，各组小鼠体重增长与对照组一致，无死亡，大体病理检查未见异常。这说明 BC99 在测试剂量下无明显急性毒性。急性实验通常只观察较短时间，若结果呈阴性，还需进行更长期的重复给药实验。
13. 亚急性经口毒性实验
亚急性实验是毒性评价体系中的关键环节，用于评估重复给药后的累积毒性。研究者按照 GB/T 15193.22-2014 标准，将 SD 大鼠分为 4 组，分别灌胃 0.125 × 1010、0.5 × 1010、2 × 1010 CFU/kg/天剂量的 BC99 悬液，连续给药 28 天。实验期间每日观察大鼠的行为和外观，末次给药后采集血液样本，用血球分析仪和生化分析仪（如 CS-480）检测血液学指标（WBC、RBC、HGB、HCT 等）、凝血指标（PT、APTT、TT、FBG）和血清生化指标（ALT、AST、ALP、TP、GLU、BU、CREA 等），并称量肝、肾、心、脾、肺等脏器重量。结果显示，各剂量组的血液学、凝血和多数生化指标与对照组无显著差异；但高剂量组（2 × 1010 CFU/kg）雄性大鼠的体重增重和肝脏重量显著降低，AST 水平也有升高。这些变化被解读为适应性反应而非毒性效应，最终确定的 NOAEL 为 0.5 × 1010 CFU/kg/天。这一结果直接支撑了 BC99 在建议剂量下的安全性，是申请功能性食品或药品注册时必需的毒理学数据。
仪器技术关系总结
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | MGI G99 短读长测序 → PacBio Sequel II 长读长测序 → Unicycler 混合组装 | 短读长提供高精度碱基，长读长跨越重复区域，二者结合获得完整环状基因组。 |
| 互补验证 | 全基因组毒力/耐药基因筛查 → 溶血实验 → 细胞毒性实验 | 基因组筛查发现潜在风险基因，再通过溶血和细胞毒性实验从表型验证其实际危害。 |
| 互补验证 | 模拟胃肠液耐受实验 → 急性/亚急性经口毒性实验 | 体外耐受实验反映肠道存活能力，体内毒性实验进一步确认在生理条件下的安全性。 |
| 因果支撑 | 全基因组 KEGG/GO 注释 → 细胞黏附与耐受实验 | 基因组中 ABC 转运、鞭毛组装等基因功能注释为菌株的耐受与黏附能力提供分子解释。 |
应用参考
对计划开展益生菌安全性评价的实验人员，可参考本研究的总体路线。以下将文献中的仪器组合转化为可借鉴方案：
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 获得高质量细菌全基因组序列，用于安全性筛查 | 短读长测序平台（如 MGI G99）+ 长读长测序平台（如 PacBio Sequel II）+ 混合组装软件（Unicycler）+ 基因注释软件（Bakta） | 短读长保证碱基准确性，长读长跨越重复区，组装出完整环状基因组，为后续毒力/耐药基因筛查和功能注释提供完整模板。前提是拥有两种测序平台，若无长读长平台，可考虑仅用短读长组装出非完成图，但需注意重复区域信息可能缺失。 |
| 快速筛查菌株的潜在毒力与耐药风险 | 全基因组序列 + VFDB、VirulenceFinder、CARD 等数据库比对 | 可在基因水平识别潜在风险基因，筛选出候选菌株。但应记住，基因存在不等于表型表达，阳性结果需要后续实验验证。 |
| 评估菌株对肠道上皮细胞的毒性及黏附能力 | HT-29 细胞系 + CytoTox 96® LDH 检测试剂盒 + 酶标仪 + 显微镜 | LDH 释放实验可定量细胞毒性，黏附实验可量化定植潜力；酶标仪用于读取 OD 值，显微镜用于细胞观察。此组合适合在体外初步筛选安全且具有定植潜力的菌株。 |
| 检测菌株对抗生素的敏感性 | 纸片扩散法 + 抗生素药敏纸片 + 血琼脂平板或 MRS 平板 | 操作简便，成本低，适合大批量初筛。若需精确 MIC 值，可结合肉汤微量稀释法。关键前提是建立合适的判定标准，如参照临床和实验室标准协会（CLSI）的折点。 |
| 评估菌株在胃肠道条件下的存活能力 | 模拟胃液/肠液制备系统 + 恒温培养箱 + 平板计数 | 模拟消化液处理后的平板计数可量化存活率，是益生菌功能评价的常规指标。需要注意模拟液的配方比例和 pH 值，需参照标准方法并调整以模拟目标人群的胃肠道条件。 |
| 确认菌株在体内的安全性，确定 NOAEL | SPF 级小鼠/大鼠模型 + 灌胃器具 + 血球分析仪 + 生化分析仪（如 CS-480）+ 解剖器械 | 急性与亚急性毒性实验是安全性评价的终点验证，血液学和生化指标可反映肝、肾功能及全身代谢的潜在影响。此组合周期长、成本高，需遵守动物伦理规范。建议在体外实验证明菌株无明显风险后再开展。 |
需要注意的是，上述方案中的具体仪器品牌和型号并非唯一选择，关键是满足实验所需的性能指标。例如，测序平台需具备足够的读长和通量；生化分析仪需能检测目标血清指标。实验人员应结合实验室现有条件选择合适设备。
在类似研究中，更稳妥的理解是：全基因组测序与生物信息学分析提供的是“风险提示”，而体外和体内实验才是“最终裁决”。基因组筛查出的潜在毒力基因不一定导致致病性，需要结合表型实验判断。因此，本文献的仪器组合体现了从基因到表型的完整证据链：测序和数据库分析确定遗传背景和风险线索，体外安全实验快速验证，最后以动物毒性实验确立安全剂量。
如果研究目标是评价其他益生菌的安全性，可参考本研究的总体设计，但需要根据具体的菌株特征调整实验内容。例如，若测序发现疑似耐药基因，应增加耐药基因转移实验；若菌株来源于非常规食品基质，应加强毒力评价。此外，本研究中 NOAEL 的确定基于高剂量组的肝重和 AST 变化，后续研究可增加组织病理学检查，以更全面地评估器官毒性。
文献信息
Wu Y, Wu Z, Gao Y, et al. Comprehensive genomic analysis and evaluation of in vivo and in vitro safety of Heyndrickxia coagulans BC99[J]. Scientific Reports, 2024. DOI: 10.1038/s41598-024-78202-y. PMID: 39496841.