神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤，高危型患者预后差，肿瘤微环境的空间组织与代谢特征如何影响疾病行为尚不清楚。该研究整合 NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler（DSP）全转录组图谱与 Akoya PhenoCycler-Fusion 高参数空间蛋白质组，对包含高危与低危儿童的神经母细胞瘤组织芯片（TMA）进行肿瘤区域与免疫微环境的分区分析。GeoMx 负责在区域水平解析转录与通路变化，PhenoCycler-Fusion 则在单细胞水平还原免疫细胞组成、空间邻域与细胞互作。两种平台的互补证据最终指向高危肿瘤中与铁死亡相关的代谢重编程和巨噬细胞相关的空间微环境，为理解肿瘤代谢-免疫互作提供空间维度依据。
空间转录组显示高危肿瘤区域富集脂肪酸代谢、ROS 信号等铁死亡相关通路，但也出现谷胱甘肽代谢升高和 GPX4 上调的抗氧化补偿特征；体外 GPX4 抑制实验进一步验证脂质过氧化与细胞死亡。空间蛋白质组则识别出与不良生存相关的巨噬细胞富集和基质隔离免疫细胞邻域，并通过共培养实验提示巨噬细胞可能增强肿瘤细胞对 GPX4 抑制剂的敏感性。这种从组织分区到细胞邻域的证据链，展示了空间多组学在微环境研究中的分工与互补价值。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 样本制备与形态学标记 | 组织芯片（TMA）、GeoMx DSP 形态学标记（SYTO 13、CD45、CD56、突触素） | 在 FFPE 切片中区分肿瘤区域与免疫微环境区域 | TMA 连续切片、ROI/AOI 空间注释 |
| 空间转录组分析 | NanoString GeoMx DSP WTA、Illumina 测序 | 比较高危与低危患者肿瘤及 TME 区域的转录差异 | ROI 水平基因表达矩阵、差异表达基因、通路富集分析结果 |
| 空间蛋白质组分析 | Akoya PhenoCycler-Fusion、QuPath 图像分析、Cellpose 细胞分割 | 在单细胞分辨率下解析免疫细胞组成与空间分布 | 单细胞蛋白表达矩阵、细胞类型注释、细胞邻域与空间邻近数据 |
| 空间邻近与细胞互作分析 | Cell 邻域分析（KNN）、G-cross 函数 | 量化不同类型细胞间的空间邻近性与邻域结构 | 细胞邻域分类、G-cross 值、邻近细胞类型频率 |
| 体外功能验证 | GPX4 抑制剂处理、IncuCyte S3 活细胞成像、流式细胞术（C11-BODIPY）、bulk RNAseq | 验证 GPX4 抑制对肿瘤细胞活力与脂质过氧化的影响 | 细胞死亡曲线、脂质过氧化水平、差异表达基因 |
| 共培养模型 | THP-1 巨噬细胞分化、肿瘤细胞共培养、CellTrace Violet 标记 | 评估巨噬细胞对肿瘤细胞铁死亡敏感性的影响 | 肿瘤细胞死亡比例（流式） |
关键环节
空间转录组区分肿瘤与 TME 区域
研究首先在 3 张 TMA 的连续切片上执行 GeoMx DSP WTA。通过荧光标记物 SYTO 13、CD45、CD56 和突触素识别细胞核、免疫细胞与肿瘤细胞，进而选取 ROI 并细分出肿瘤区域（CD56+突触素+）和 TME 区域（CD45+）。这种分割策略不是为了单纯看基因数量，而是为了在组织原位比较同一患者切片中不同微环境区域的转录差异。GeoMx 的 ROI 技术价值在于，它能够在形态学引导下富集目标细胞群，避免整块组织匀浆带来的信号稀释，从而让后续高危与低危比较更贴近特定区域。质量控制和 TMM 标准化后，67 个 ROI 进入分析；PCA 显示肿瘤与 TME 区域明显分离，风险相关变异主要由 PC2 解释，这为后续差异表达和通路富集提供了可靠的区域特异性基础。
空间转录组揭示铁死亡相关代谢失衡
在高危肿瘤区域内，差异表达基因和 GSEA 显示脂肪酸代谢、ROS 通路、氧化磷酸化、缺氧与谷胱甘肽代谢共同上调。单独看某一通路容易误解为单纯代谢活跃，但联合 NCOA4、TFRC、FTH1、ACSL4 等促铁死亡基因与 GPX4、SLC1A5、CBS 等抗铁死亡基因的同时升高，才能看出高危肿瘤处于一种促氧化与抗氧化并存的张力状态。GeoMx 的区域数据没有直接杀死细胞，而是先在组织原位给出“高危肿瘤可能依赖 GPX4 抗氧化来缓冲铁死亡压力”的线索。随后 TARGET 数据库中 GPX4 高表达与较差总生存相关，以及体外 GPX4 抑制实验导致的脂质过氧化和活力下降，均与这一空间转录组线索相呼应，形成从组织表达到功能验证的证据链。
空间蛋白质组解析细胞邻域与预后关联
PhenoCycler-Fusion 使用 53 个抗体标记在同一张切片上循环染色成像，得到单细胞分辨率的蛋白表达数据。研究中依赖 QuPath 做图像质量控制和细胞分割，并用自训练的 Cellpose 模型识别细胞核，再通过聚类和人工注释分出肿瘤细胞、T 细胞亚群、B 细胞、巨噬细胞及基质细胞等 12 种主要细胞类型。这一平台的空间价值体现在后续的邻域分析上：仅比较细胞比例时，高危与低危之间并没有显著差异；但将每个细胞周围最近 10 个细胞类型纳入无监督 KNN 聚类后，发现巨噬细胞富集的 CN4 和基质隔离免疫细胞的 CN6 在高危组和复发组中比例更高，并且与 5 年生存较差相关。这提示预后相关因素不只是免疫细胞丰度，而是细胞在空间上的组织方式。G-cross 函数进一步量化了 CN4 内 M1/M2 巨噬细胞、基质细胞和肿瘤细胞间的近距离共定位，为巨噬细胞-肿瘤互作提供空间邻近证据。
体外模型与共培养验证空间发现的生物学意义
为验证 GeoMx 提出的 GPX4 依赖抗氧化假说，研究者用 GPX4 抑制剂 ML210、FIN56 和 FINO2 处理 MYCN 扩增型 SK-N-BE(2) 和非扩增型 SK-N-AS 细胞。IncuCyte S3 活细胞成像实时记录 PI 阳性细胞比例，流式检测 C11-BODIPY 氧化信号以评估脂质过氧化。结果显示 GPX4 抑制增加脂质过氧化并降低细胞活力，与铁死亡相关过程一致；bulk RNAseq 还显示 MYCN 扩增细胞对 GPX4 抑制出现铁代谢基因上调，提示铁代谢可能参与该过程。研究特别指出未用 Ferrostatin-1 或铁螯合剂做回复实验，因此当前结果尚不能完全等同于铁死亡，这一边界说明体现了方法学上的克制。共培养实验中，将 SK-N-BE(2) 或 SK-N-AS 与 THP-1 分化的 M0、M1、M2 巨噬细胞以 1:1 比例混合并在 FINO2 存在下共培养，流式结果显示巨噬细胞显著增强肿瘤细胞对 GPX4 抑制剂的死亡反应，提示细胞间直接接触可能影响铁死亡敏感性。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程互补 | GeoMx DSP WTA → PhenoCycler-Fusion | 同一 TMA 的连续切片分别做转录组和蛋白质组，由区域整体表达过渡到单细胞空间分布，构成从“粗分区”到“细定位”的研究流程。 |
| 验证互补 | 空间转录组 → TARGET 生存分析 / 体外 GPX4 抑制 | 空间转录组发现的 GPX4 上调在 TARGET 数据库和体外抑制实验中得到功能呼应，将空间表观与患者生存和细胞反应关联。 |
| 空间证据链 | PhenoCycler-Fusion 邻域分析 + G-cross → 共培养实验 | 空间蛋白质组识别出巨噬细胞-肿瘤原位共定位，共培养实验进一步验证这种邻近关系可能增强肿瘤对 GPX4 抑制的敏感性。 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 区分肿瘤区域与免疫微环境的代谢差异 | GeoMx DSP + 形态学标记（CD45、CD56、突触素） | 在组织原位划分肿瘤与 TME 区域，获得区域特异性转录信号，适合初步筛选差异通路，但需要确保 ROI 注释准确性。 |
| 解析免疫细胞组成与空间组织 | PhenoCycler-Fusion + QuPath + Cellpose + 邻域分析 | 单细胞分辨率识别细胞类型和空间邻域，比单纯比例分析更能揭示与预后相关的空间结构，适合评估免疫排斥或富集模式。 |
| 从空间线索走向机制假设 | 空间转录组 + 空间蛋白质组 + 体外共培养 | 先确定感兴趣的区域和通路，再用细胞模型验证关键靶点，实现从组织观察到功能验证的闭环。 |
使用该组合时需注意：GeoMx DSP 适合已明确分区标记的组织，且 ROI 形态学判读依赖病理经验；PhenoCycler-Fusion 数据分析较复杂，质量和批次控制、细胞分割模型训练均需投入计算资源。共培养实验不能完全替代体内微环境，巨噬细胞对铁死亡敏感性的影响仍需在动物模型中确认。更稳妥的理解是，这类空间多组学组合擅长生成空间分布和邻近性证据，为后续功能实验提供靶向性假设，而非直接证明因果机制。
文献信息
Tu C, Tan CW, Monkman J, et al. Spatial multi-omics characterization of neuroblastoma reveals ferroptosis-associated metabolic features in high-risk tumors. Genome Medicine, 2026. DOI: 10.1186/s13073-026-01622-0. PMID: 41918107.