该研究利用自发性黑色素瘤小鼠模型 tg(Grm1)EPv，探讨谷氨酸代谢重编程对肿瘤微环境中树突状细胞（DC）功能的影响，并评估靶向谷胱甘肽代谢的抑制剂 BSO 联合 DC 增强疗法的抗肿瘤效果。研究整合 LC-MS/MS 靶向代谢组学、RNA 测序和流式细胞术，系统解析了肿瘤进展中的代谢特征和免疫浸润动态，为代谢干预联合免疫治疗提供了实验依据。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 临床相关性分析 | TCGA 转录组数据、GSVA 生存分析 | GRM1 和谷氨酰胺代谢基因是否与黑色素瘤患者生存相关 | Kaplan-Meier 生存曲线、风险分组 |
| 肿瘤分期与代谢物提取 | 游标卡尺、组织匀浆器 | 区分肿瘤不同阶段并制备代谢物样本 | 耳厚、耳重、组织代谢物提取物 |
| 代谢物定量 | LC-MS/MS（HILIC 色谱柱、QTrap 质谱） | 肿瘤进展中糖酵解、TCA 循环和氨基酸代谢的定量变化 | 代谢物浓度、乳酸/葡萄糖和乳酸/丙酮酸比值 |
| 转录组分析 | RNA-seq（QuantSeq 文库、Illumina NovaSeq） | 肿瘤进展中代谢和免疫相关基因表达变化 | 差异表达基因、通路富集、热图 |
| 免疫细胞分析 | 26 色流式细胞术（Cytek Aurora、CytoFLEX S） | 肿瘤微环境中免疫细胞亚群及其活化表型变化 | 细胞频率、绝对计数、UMAP 降维图 |
| 细胞死亡机制研究 | IncuCyte 活细胞成像、流式细胞术（ROS、脂质过氧化）、细胞外 ATP 检测 | BSO 是否诱导铁死亡及其机制 | 细胞活力、死亡动态、ROS 水平、脂质过氧化信号、ATP 释放 |
| 体内治疗实验 | 肿瘤生长测量、RNA-seq、流式细胞术 | BSO 联合 DC 疗法是否控制肿瘤生长并改变免疫浸润 | 肿瘤生长曲线、存活率、免疫细胞频数和基因表达 |
关键环节
代谢组学揭示 Warburg 效应与谷氨酰胺代谢重编程
研究首先在 TCGA 黑色素瘤数据中发现 GRM1 及谷氨酰胺代谢基因高表达与较差生存相关。随后使用 LC-MS/MS 对 EPv 小鼠不同阶段肿瘤组织进行靶向代谢组学分析，检测糖酵解、TCA 循环及氨基酸代谢物。结果显示尽管多数代谢物减少，乳酸/葡萄糖和乳酸/丙酮酸比值升高，提示有氧糖酵解增强；α-酮戊二酸显著增加而其他 TCA 代谢物降低，提示谷氨酰胺回补途径活跃。这些数据揭示了肿瘤微环境中代谢竞争可能限制免疫细胞营养供应。
转录组与代谢组整合分析代谢通路改变
RNA-seq 数据显示糖酵解和谷氨酰胺代谢基因上调，而 TCA 循环基因下调，支持代谢组学观察到的谷氨酰胺回补作用。利用 GO 分析进一步确认谷氨酰胺代谢过程的富集。多组学数据相互印证，构建了肿瘤代谢重编程的完整图像。
流式细胞术量化免疫细胞亚群动态
通过 26 色流式细胞术和 FlowSOM 无监督聚类，研究鉴定了肿瘤浸润的 11 个髓系细胞亚群，包括中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和 DC 亚群。结果显示早期肿瘤中 DC 和巨噬细胞增加，但晚期肿瘤中活化 DC 减少、PD-L1 表达增加、中性粒细胞增多，呈现免疫抑制和耗竭表型。这些数据证实了代谢改变与免疫抑制微环境的相关性。
体外机制实验验证 BSO 诱导铁死亡
体外实验发现 Grm1 阳性黑色素瘤细胞对 BSO 和 IKE 敏感，而 Grm1 阴性细胞不敏感。通过 IncuCyte 实时监测细胞死亡，利用 DCFDA 检测 ROS，BODIPY 检测脂质过氧化，以及细胞外 ATP 释放实验，证实 BSO 诱导铁死亡。铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 逆转了 BSO 的细胞毒性，进一步印证了机制特异性。
体内联合治疗与转录组分析
BSO 联合 DC 增强疗法（Flt3L、polyI:C、抗 CD40 抗体）显著抑制肿瘤生长，延长生存期。RNA-seq 显示联合治疗上调干扰素刺激基因、铁死亡驱动基因和 T 细胞活化相关基因。流式细胞术进一步证实肿瘤浸润的活化 DC（CD40+PD-L1−）和产生 IFNγ/TNFα 的 CD4+、CD8+ T 细胞增加， CD8/Treg 比例升高，说明联合治疗重塑免疫微环境至抗肿瘤状态。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 互补验证 | LC-MS/MS 与 RNA-seq | 代谢组学提供代谢物浓度变化，转录组揭示相关酶和转运体表达变化，两者共同确认谷氨酰胺代谢重编程方向。 |
| 表型与机制验证 | 流式细胞术与 RNA-seq | 流式定量免疫细胞亚群和活化标志，RNA-seq 提供细胞毒性、趋化因子和抗原提呈相关基因表达证据。流式对蛋白表型的分辨与转录组对基因调控的覆盖相互补充。 |
| 体外筛选与体内验证 | IncuCyte 与体内治疗实验 | IncuCyte 筛选出 BSO 的细胞致死效应，确定机制为铁死亡，为体内联合治疗提供依据。体内肿瘤生长和免疫分析验证了干预效果。 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 解析肿瘤微环境代谢特征 | LC-MS/MS 靶向代谢组学 + RNA-seq | 定量代谢物并关联基因表达，识别关键代谢通路改变。 |
| 分析免疫细胞亚群和功能状态 | 多色流式细胞术 + UMAP/FlowSOM 算法 | 无偏差鉴定免疫亚群及其表型变化，尤其适用于复杂髓系群体。 |
| 评估代谢干预对免疫治疗的影响 | IncuCyte 细胞实时监测 + 体内治疗 + 多色流式/RNA-seq | 体外筛选有效代谢抑制剂，体内验证免疫重塑和疗效的免疫机制。 |
选取组合时需注意：LC-MS/MS 需根据目标代谢物选择色谱柱和衍生产方法，本研究中糖酵解和 TCA 代谢物采用 HILIC 负离子模式，氨基酸采用 C18 正离子模式；流式分析需针对组织类型验证抗体组合和染色条件；体内实验需明确给药剂量和时序并监测毒性。不同仪器组合适用于不同实验阶段和科学问题，需结合具体研究目标进行设计。
文献信息
Dieckmann SM, Tripp CH, Strandt H, et al. Metabolic inhibition of glutamate-cysteine ligase increases dendritic cell-mediated antitumor immunity in melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 2026. doi:10.1136/jitc-2026-014808。PMID: 42379703。