肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中具有显著的异质性，其来源包括自我更新的组织驻留巨噬细胞和由单核细胞分化而来的巨噬细胞，但两类细胞在肿瘤进展中的不同作用尚不明确。该研究以人类早期非小细胞肺癌（NSCLC）和相应的原位小鼠模型为对象，结合单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和谱系追踪技术，区分了肿瘤相关巨噬细胞的两种不同起源，并进一步通过空间成像、细胞共培养、ATAC-seq 和巨噬细胞清除模型，揭示组织驻留巨噬细胞在肿瘤形成早期靠近肿瘤细胞，促进肿瘤细胞上皮间质转化（EMT）和侵袭性，同时诱导调节性 T 细胞（Treg）应答，从而在早期肺癌中塑造促肿瘤微环境。
实验路线分为几个层次：利用 scRNA-seq 鉴定肿瘤浸润白细胞中的巨噬细胞亚群；通过谱系追踪小鼠模型区分巨噬细胞的胚胎起源和成体造血起源；结合组织透明化和共聚焦成像观察不同巨噬细胞亚群在肿瘤中的空间分布随时间的变化；通过 3D 共培养体系和 transwell 实验验证组织驻留巨噬细胞对肿瘤细胞行为的影响；利用巨噬细胞清除模型评估其在体内对肿瘤生长和免疫微环境的作用。核心仪器和技术包括单细胞测序平台、流式细胞分选、共聚焦显微镜、活细胞成像系统等，这些工具在证据链中分别承担细胞异质性解析、细胞起源判定、空间分布定位和功能验证等关键任务。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 肿瘤相关白细胞单细胞转录组分析 | 10x Genomics Chromium 单细胞 3′ 转录组测序；Illumina NextSeq 550 测序 | 人类和小鼠 NSCLC 病灶中巨噬细胞的异质性及亚群分类 | 巨噬细胞和单核细胞亚群的转录组特征（UMI 计数矩阵、聚类图谱） |
| 巨噬细胞起源追踪 | Map17-creER 与 Cx3cr1-creER 谱系追踪小鼠模型；流式细胞分选（BD FACSAria） | 区分胚胎来源的组织驻留巨噬细胞与成体造血来源的单核细胞衍生巨噬细胞 | 各亚群中 Tomato 或 YFP 标记细胞比例，判定各亚群的发育起源 |
| 组织透明化及共聚焦成像 | 组织透明化处理（uDISCO 流程）；共聚焦显微镜（Leica TCS SP8） | 观察肿瘤不同阶段巨噬细胞亚群与肿瘤细胞的时空分布关系 | 肿瘤病灶内各细胞类型的空间坐标和邻近关系数据 |
| 肿瘤细胞与巨噬细胞共培养 | 3D 球体培养；IncuCyte S3 活细胞成像；Leica DMI8 显微镜 | 组织驻留巨噬细胞对肿瘤细胞 EMT 和侵袭能力的直接影响 | 肿瘤细胞迁移、EMT 标志蛋白表达、侵袭性突出形成等数据 |
| 转录组和表观组分析 | 超低起始量 RNA-seq（Smart-Seq v4）；ATAC-seq | 组织驻留巨噬细胞对早期肿瘤信号的反应及染色质状态变化 | 差异表达基因、染色质开放性区域（peak）及功能富集数据 |
| 巨噬细胞清除模型 | CD169-DTR 小鼠；白喉毒素处理；流式细胞术；免疫组化 | 组织驻留巨噬细胞在体内对肿瘤生长和免疫微环境的功能贡献 | 肿瘤负荷、Treg 数量与表型、CD8+ T 细胞浸润等数据 |
关键环节
单细胞转录组鉴定巨噬细胞亚群
在人和小鼠 NSCLC 病灶中，通过 scRNA-seq 将肿瘤相关髓系细胞分为四个主要类群，其中 group I 表达 Pparg、Mrc1、Marco、Siglecf 等基因且高表达细胞周期基因，提示其具有自我更新能力，与肺泡巨噬细胞特征一致；group II 则高表达 C1q、Arg1、Trem2 等，这些类群在不同物种间保守，为后续功能研究提供了分子基础。scRNA-seq 在此环节的作用是提供单细胞水平的转录组图谱，使亚群的划分不依赖有限的表面标记，而是基于全转录组特征。
谱系追踪区分巨噬细胞起源
通过两种独立的诱导型 Cre 系统标记成体造血干细胞及其后代，流式分选后再进行 scRNA-seq，明确 group I 几乎不被标记，而其他类群高比例被标记，从而在体内确认 group I 是胚胎来源的组织驻留巨噬细胞，且即使在肿瘤进展期也不由单核细胞补充。谱系追踪结合单细胞测序，将转录组类群与发育起源直接关联，是本研究证据链的核心环节，避免了仅凭标志物推断起源的局限。
空间成像揭示巨噬细胞亚群分布动态
利用组织透明化处理后的全肺免疫染色和共聚焦成像，观察到 KP 肿瘤细胞注射后第 5～15 天，组织驻留巨噬细胞（MRC1+ 或 CD206+）密集分布于肿瘤细胞周围，而随着肿瘤进展（第 25～30 天），这些细胞逐渐被重塑到肿瘤外周，中央区域则由单核细胞衍生巨噬细胞占据。此技术提供了细胞空间分布的直接证据，表明不同起源的巨噬细胞在肿瘤不同阶段占据不同生态位，提示早期接触可能对肿瘤起始至关重要。
功能验证组织驻留巨噬细胞对肿瘤细胞的直接作用
利用 3D 球体共培养系统，将 KP 细胞分别与组织驻留巨噬细胞或骨髓单核细胞共培养，发现与组织驻留巨噬细胞共培养的肿瘤细胞上调 EMT 和迁移相关基因，下调 E-cadherin，并形成侵袭性突出，而单核细胞共培养则主要促进细胞周期基因表达。通过活细胞成像和 transwell 迁移实验进一步验证了促侵袭表型，其中时间序列成像用于追踪肿瘤细胞分散动态，免疫荧光染色用于检测相关蛋白表达，这些实验证明两种巨噬细胞对肿瘤细胞的影响存在质的不同。
表观遗传分析早期反应特征
对早期（第 15 天）和晚期（第 30 天）的肿瘤相关组织驻留巨噬细胞进行 ATAC-seq，发现染色质开放性变化主要集中在早期，并涉及 Mmp12、Mmp13、MHC II 类基因等区域，而后期变化较少，表明组织驻留巨噬细胞在肿瘤信号刺激下染色质变化相对有限，转录改变主要涉及抗原呈递和组织重塑。ATAC-seq 在分析转录调控机制时至关重要，可提示哪些基因的预设开放性位点被启用，以及转录因子结合位点的可及性变化。
巨噬细胞清除模型验证功能贡献
利用 CD169-DTR 转基因小鼠，通过白喉毒素特异性清除组织驻留巨噬细胞而不影响单核细胞衍生巨噬细胞。清除后肿瘤负荷显著减少，Treg 细胞数量下降且表型改变（CTLA-4 和 CD73 表达降低），CD8+ T 细胞浸润增加。通过流式细胞术和免疫组化（包括多轮免疫组化染色）对肿瘤组织进行量化分析。该模型直接证明组织驻留巨噬细胞在早期阶段通过促进 Treg 应答塑造免疫抑制微环境，并在功能上促进肿瘤生长。
技术协同
单细胞测序用于初步分群并发现候选标记物，谱系追踪将这些类群与发育起源联系；空间成像把分布动态与肿瘤进展阶段联系起来；体外共培养和体内清除模型则用于验证因果关系。ATAC-seq 提供染色质层面的机制支持。各项技术的互补关系可总结如下。
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 互补 | scRNA-seq；谱系追踪 | scRNA-seq 提供转录组亚群，谱系追踪提供起源证据，两者结合确认亚群性质 |
| 验证 | 组织透明化成像；巨噬细胞清除模型 | 成像观察到早期接触现象，清除模型验证其功能意义 |
| 干预 | 巨噬细胞清除模型；体外共培养 | 体内清除改变肿瘤微环境，体外共培养验证细胞直接相互作用 |
| 机制支持 | ATAC-seq；bulk RNA-seq | 基因表达改变与染色质开放性变化关联，支持转录调控推断 |
研究组合
在类似研究中，可根据具体目标选择仪器组合。如果研究目标是区分肿瘤相关巨噬细胞亚群的起源及其功能差异，可参考 scRNA-seq 结合谱系追踪的方法，先以转录组定义亚群，再用遗传工具确认发育关系；如果目标是分析不同免疫细胞的空间分布及相互作用时间，可采用组织透明化和共聚焦成像技术，并配合细胞表型标记进行多点定量；如果目标是评估特定巨噬细胞亚群在肿瘤进展中的功能贡献，可利用条件性清除模型并在不同时间点进行干预，结合流式细胞术和多标记免疫组化进行监测。
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 解析肿瘤相关巨噬细胞异质性 | 单细胞 RNA 测序（10x Genomics）＋流式细胞分选 | 获得单细胞转录组、明确亚群表面表型 |
| 确认细胞起源 | 诱导型 Cre 谱系追踪小鼠＋流式分选＋scRNA-seq | 在单细胞水平关联转录组与谱系标记 |
| 观察细胞空间分布动态 | 组织透明化处理＋共聚焦显微镜 | 保留完整组织信息，获高质量三维图像 |
| 验证细胞间功能影响 | 3D 共培养＋活细胞成像＋transwell 实验 | 体外条件下验证相互作用表型 |
| 评估体内功能与免疫效应 | 巨噬细胞清除模型＋流式细胞术＋免疫组化 | 提供功能验证和免疫微环境表型数据 |
需要注意的是，不同仪器组合的应用前提与边界条件不同。单细胞 RNA 测序对细胞活性要求高，解离过程可能影响基因表达；组织透明化处理可能对抗原表位产生一定影响；清除模型则依赖于细胞表面标志物表达的特异性。在类似研究中，需要结合具体实验条件和研究问题设计相应的技术路线。
文献信息
Casanova-Acebes M, Dalla E, Leader AM, et al. Tissue-resident macrophages provide a pro-tumorigenic niche to early NSCLC cells. Nature, 2021, 595(7868): 578-584.