口腔鳞状细胞癌（OSCC）的肿瘤微环境（TME）中，肿瘤相关巨噬细胞、T 细胞、成纤维细胞和内皮细胞等非肿瘤成分与肿瘤进展密切相关。CCR7 作为趋化因子受体，已被证实在多种肿瘤中促进增殖与转移，但其对 OSCC 微环境的具体作用尚不清楚。本研究构建了 CCR7 基因敲除（KO）小鼠与野生型（WT）小鼠的 OSCC 皮下移植瘤模型，利用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）解析两组肿瘤微环境的细胞组成与转录差异，并结合免疫组化、免疫荧光染色、流式细胞术和体外实验，验证 CCR7 对 M2 巨噬细胞极化的调控作用。核心仪器 scRNA-seq 承担了微环境细胞图谱构建、差异基因识别、细胞间通讯分析和轨迹推断等关键任务，为后续靶向验证提供了空间与细胞层面的线索。
研究结果显示，KO 组肿瘤生长速率显著低于 WT 组；scRNA-seq 鉴定出 8 种主要细胞类型，KO 组肿瘤细胞比例降低而炎症细胞比例升高；巨噬细胞亚群分析提示 KO 组 M2 巨噬细胞比例下降，免疫组化、免疫荧光和流式细胞术均验证了这一趋势；体外实验进一步表明 CCR7 可促进 M2 巨噬细胞极化，进而增强 OSCC 细胞的增殖、侵袭和迁移能力。Dusp1 在 KO 组多种基质细胞中表达普遍升高，提示 CCR7 可能通过抑制 Dusp1 表达来促进 M2 极化。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| CCR7 敲除小鼠与 OSCC 模型构建 | 皮下注射 MOC-1/MOC-2 细胞、数显卡尺测量 | 建立同源移植瘤模型，比较 KO 与 WT 组肿瘤生长差异 | 肿瘤体积生长曲线、肿瘤组织样本 |
| 单细胞 RNA 测序 | 10 × Genomics 平台、Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit V3 | 获取 KO 与 WT 组肿瘤微环境单细胞转录组图谱 | 单细胞表达矩阵、细胞聚类与注释结果 |
| 生物信息学分析 | Seurat、SingleR、inferCNV、CellPhoneDB、Monocle 2、SCENIC、GSEA、GSVA | 鉴定细胞类型、恶性细胞、差异基因、细胞间通讯、轨迹和转录因子 | 细胞比例、差异基因列表、富集通路、受体-配体对、拟时序轨迹 |
| 关键蛋白表达验证 | 免疫组化、免疫荧光染色、共聚焦激光扫描显微镜 | 验证 KO 与 WT 组 M2 巨噬细胞和 Dusp1/MKP-1 表达差异 | 组织切片染色图像、阳性细胞定位与表达强度 |
| 免疫细胞比例定量 | 流式细胞术、MACS 细胞分选系统 | 定量 KO 与 WT 组 M2 巨噬细胞占炎症细胞比例 | 流式细胞术散点图与比例统计 |
| 体外功能验证 | THP-1 诱导、RT-qPCR、CCK-8、Transwell、划痕实验 | 验证 CCR7 对 M2 极化及 OSCC 细胞增殖、侵袭、迁移的影响 | M2 标志基因表达、增殖曲线、迁移侵袭细胞计数、划痕愈合率 |
关键环节
CCR7 敲除小鼠与 OSCC 模型的建立是后续微环境分析的前提。研究将相同数量与特性的 MOC-1 或 MOC-2 细胞注射到 KO 与 WT 小鼠侧腹，使用数显卡尺每两天测量肿瘤长宽并计算体积。该设计使两组间肿瘤细胞来源一致，从而将生长差异归因于宿主微环境的变化。结果显示 KO 组肿瘤生长速率显著低于 WT 组，MOC-2 种植后第 20 天 WT 组肿瘤体积约 1593.86 ± 273.37 mm³，KO 组约 640.46 ± 189.88 mm³；MOC-1 种植后第 24 天 WT 组约 640.52 ± 55.32 mm³，KO 组约 231.30 ± 24.67 mm³。免疫组化显示 CCR7 在 KO 组基质细胞中表达显著低于 WT 组，为后续微环境差异分析提供了模型基础。
单细胞 RNA 测序承担了从组织样本到细胞图谱的核心转换。研究从 WT 组（B2、B9、B47）和 KO 组（B30、B76、B77）肿瘤组织中解离单细胞，使用 10 × Genomics 平台构建文库并测序。初步质控后获得 70316 个细胞，经 DoubletFinder 排除多细胞干扰后保留 58836 个细胞用于分析。Seurat 降维聚类和 t-SNE 可视化得到 25 个细胞簇，SingleR 初步注释免疫细胞，inferCNV 区分良恶性细胞，最终鉴定出 8 种主要细胞类型：肿瘤细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、粒细胞、T 细胞、内皮细胞、单核细胞和 B 细胞。KO 组肿瘤细胞比例降低、炎症细胞比例升高，单核细胞比例在 KO 组较高但占总细胞比例很小。这些数据表明 CCR7 敲除重塑了 OSCC 微环境的细胞组成。
细胞间通讯与轨迹分析用于解析微环境中的信号网络和分化路径。CellPhoneDB 分析显示肿瘤细胞与巨噬细胞、内皮细胞、单核细胞和 T 细胞存在强相互作用，KO 与 WT 组受体-配体对存在差异。Monocle 2 轨迹分析对肿瘤细胞进行拟时序推断，BEAM 分析揭示不同分支节点富集于「细胞连接组织」「细胞外基质组织」「上皮细胞迁移调控」和「MAPK 级联调控」等通路，动态变化最显著的基因 Bcam、Cdh1、Ifrd1、Mxd1 和 Timp1 经 GEPIA2 分析显示与肿瘤患者生存相关。SCENIC 分析显示 KO 组前 5 位转录因子为 Grhl2、Grhl1、Maz、Foxo1 和 Esrra，WT 组为 Nebfk2、Cr3bl2、E2f3、Atf5 和 Creb3l1。这些分析从通讯和分化层面补充了微环境差异的证据链。
M2 巨噬细胞是 CCR7 调控 OSCC 微环境的关键细胞类型。巨噬细胞亚群再聚类获得 9 个簇，根据 CD206（Mrc1）标记基因表达将簇 2、3、5 定义为 M2 巨噬细胞。scRNA-seq 显示 KO 组 M2 巨噬细胞占炎症细胞比例低于 WT 组（P < 0.05）。免疫组化与免疫荧光染色使用 F4/80 和 CD206 抗体，在 MOC-1 或 MOC-2 种植的 KO 组肿瘤组织中均观察到较少的 M2 巨噬细胞。流式细胞术使用 CD45 磁珠分选、CD11b-APC、MHC class II-FITC 和 CD206-PE 抗体，进一步定量证实 KO 组 M2 细胞占炎症细胞比例显著低于 WT 组。三种技术从组织定位、蛋白表达和细胞比例层面形成一致的证据。
体外实验用于验证 CCR7 对 M2 极化的直接作用。THP-1 细胞经 PMA 诱导为 M0 巨噬细胞，再经 IL-4 和 IL-13 诱导为 M2 巨噬细胞，RT-qPCR 显示 M2 组 CD206、ARG-1、IL-10 和 TGF-β 表达高于 M0 组，确认诱导成功。加入 CCR7 mAb 后上述 M2 标志基因表达显著受抑。将 M2 巨噬细胞与 PCI-4B、PCI-37B 细胞共培养，Transwell 实验显示肿瘤细胞迁移和侵袭能力增强，而经 CCR7 mAb 预处理的 M2 巨噬细胞则使肿瘤细胞迁移和侵袭能力显著下降；划痕实验和 CCK-8 实验得到一致结果。这些体外数据支持 CCR7 通过促进 M2 极化来增强 OSCC 细胞的增殖、迁移和侵袭。
Dusp1 表达差异将 CCR7 与 M2 极化联系起来。scRNA-seq 结果显示 KO 组 Dusp1 mRNA 在 B 细胞、T 细胞、内皮细胞、粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和成纤维细胞中普遍高于 WT 组。RT-qPCR 显示 CCR7 mAb 可促进体外诱导的 M2 巨噬细胞中 Dusp1 表达。免疫荧光染色显示 MKP-1（由 Dusp1 编码）主要定位于 M2 巨噬细胞，且在 CCR7 敲除组表达更高。结合既往研究提示 Dusp1 缺陷可促进 OSCC 生长和 M2 极化，研究提出 CCR7 通过抑制 Dusp1 表达来促进 M2 巨噬细胞极化。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 发现与验证 | scRNA-seq 与免疫组化、免疫荧光、流式细胞术 | scRNA-seq 发现 KO 组 M2 巨噬细胞比例下降，免疫组化和免疫荧光在原位验证蛋白表达与定位，流式细胞术定量细胞比例，三者从不同层面证实同一结论 |
| 互补验证 | scRNA-seq 与 RT-qPCR | scRNA-seq 提示 KO 组 Dusp1 表达升高，RT-qPCR 在体外 M2 巨噬细胞中验证 CCR7 mAb 对 Dusp1 的调控 |
| 干预与功能验证 | CCR7 敲除模型与 CCR7 mAb 体外实验 | 体内敲除模型显示 CCR7 缺失抑制肿瘤生长和 M2 极化，体外抗体阻断实验直接验证 CCR7 对 M2 极化和肿瘤细胞功能的促进作用 |
| 空间与细胞层面整合 | 免疫荧光共聚焦与 scRNA-seq | 免疫荧光显示 MKP-1 定位于 M2 巨噬细胞，scRNA-seq 显示 Dusp1 在多种基质细胞中差异表达，两者结合将分子表达与细胞类型关联 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 解析基因敲除对肿瘤微环境细胞组成的影响 | 单细胞 RNA 测序 + 生物信息学聚类与注释 | 在单细胞水平获取微环境细胞图谱，识别细胞类型比例变化和差异基因，适用于免疫浸润和组织结构研究 |
| 验证特定细胞亚群在组织中的分布与比例 | 免疫组化 + 免疫荧光染色 + 流式细胞术 | 免疫组化和免疫荧光提供组织原位定位与蛋白表达信息，流式细胞术提供悬液细胞比例定量，三者互补验证 |
| 研究细胞间通讯与信号网络 | scRNA-seq + CellPhoneDB + 轨迹分析 | 推断受体-配体互作关系与细胞分化路径，适合探索微环境中细胞间相互作用的候选机制 |
| 验证候选分子对免疫细胞功能的调控 | 体外诱导模型 + RT-qPCR + 功能实验 | 在受控条件下验证目标分子对免疫细胞极化的直接作用，并评估其对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响 |
在类似研究中，若研究目标是解析某一基因或干预因素对肿瘤微环境的影响，单细胞 RNA 测序可作为发现工具，用于识别细胞组成变化和差异表达基因；免疫组化、免疫荧光和流式细胞术适合作为原位和定量验证手段。需要注意的是，scRNA-seq 的样本量和测序深度会影响细胞类型鉴定的完整性，免疫组化和流式细胞术的抗体选择与设门策略会影响验证结果的可靠性。研究组合的价值取决于是否能形成从发现到验证的逻辑闭环，而不是仪器数量的堆叠。适用前提是具备相应的动物模型或临床样本，并且有明确的微环境细胞类型作为分析对象。
文献信息
Wang Z, Kirkwood KL, Wang Y, et al. Analysis of the effect of CCR7 on the microenvironment of mouse oral squamous cell carcinoma by single-cell RNA sequencing technology. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2024, 43: 94. PMID: 38539232. DOI: 10.1186/s13046-024-03013-y.