胶质母细胞瘤（GBM）的浸润性生长使完全手术切除难以实现，而肿瘤细胞所处的脑组织微环境在空间上高度不均一，氧气与葡萄糖的可及性随脑区变化。倍性不同的肿瘤细胞对代谢底物的需求不同：全基因组加倍（WGD）阳性的高倍性细胞需要更多资源来复制增加的 DNA 并合成更多 RNA 与蛋白质，因此在资源稀缺环境中可能更早停止增殖、启动迁移。本研究要解决的细胞功能问题是：细胞倍性是否影响其在低糖条件下的迁移、增殖与死亡速率，以及这类体外差异能否为描述 GBM 生长与浸润的数学模型提供参数。
为此，研究采用两条 GBM 细胞系 KALS-1（倍性 3.06，简称 3N）与 42-MG-BA（倍性 3.83，简称 4N），在双室培养体系（Clearview Cell Migration plate，Sartorius 4582）中设置上室葡萄糖浓度 0.25～11.11 mM、下室恒为 25 mM，用 IncuCyte S3 活细胞成像系统以趋化实验模式每 2 h 采集一次图像、持续 48 h，共获得 64 孔、每孔 37 个时间点、6 个通道的 21,312 张原始图像；再用 HALO AI 图像分析平台将细胞分割并分类为顶层存活、底层存活和顶层死亡三类，配合常微分方程（ODE）模型拟合出不同葡萄糖浓度下的迁移、增殖与死亡速率，最终用于设定 S3MB 模型中与葡萄糖依赖迁移相关的参数。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 细胞系鉴定与倍性确认 | 短串联重复（STR）分析 | 确认 KALS-1 与 42-MG-BA 的细胞身份，明确 3N 与 4N 倍性差异 | 细胞身份与倍性数值（3.06 与 3.83） |
| 葡萄糖梯度下迁移实验 | Clearview Cell Migration plate 双室培养体系（8 μm 孔径） | 在上室设置 0.25～11.11 mM 葡萄糖梯度，下室恒定 25 mM，诱导定向迁移 | 跨膜迁移的活细胞与死细胞分布 |
| 活细胞动态成像 | IncuCyte S3 活细胞成像系统（趋化实验模式，GUI 版本 2021A） | 每 2 h 连续记录上层与下层细胞的时空变化，持续 48 h | 21,312 张原始图像（6 通道、64 孔、每孔 37 个时间点） |
| 图像分割与细胞分类 | HALO AI 图像分析平台（Ver 3.6.4134） | 将细胞分割并分类为顶层存活、底层存活、顶层死亡 | 三类细胞在各时间点的计数 |
| 动力学参数拟合 | ODE 迁移模型 | 解析顶层活细胞增殖率 λT、迁移率 μ 与死亡率 δ，拟合五种葡萄糖浓度 | 不同葡萄糖浓度下的迁移、增殖与死亡速率 |
| 参数向模型迁移 | S3MB（MATLAB 实现） | 将体外迁移差异转化为 vmax 与 bmig，用于模拟体内迁移 | 葡萄糖依赖的迁移参数取值 |
关键环节
双室体系与葡萄糖梯度设置
该环节回答的核心问题是：在葡萄糖供给受限时，不同倍性 GBM 细胞的迁移行为是否存在差异。双室培养体系的作用在于把葡萄糖梯度固定为可量化的边界条件——下室葡萄糖与透析胎牛血清（dFBS）浓度恒定在 25 mM 与 0.1%～10%，上室葡萄糖在 0.25～11.11 mM 之间变化，细胞经 8 μm 孔径从上室迁移至下室。选择这一体系而不是单一培养皿，是因为迁移终点位于物理隔开的第二室，可以将「穿过孔径进入下室」与「留在上室」明确区分为两个可计数的细胞群体。产生的数据是上、下两室中活细胞与死细胞随时间的分布，直接支撑「4N 细胞在各葡萄糖浓度下迁移均快于 3N 细胞」这一结论。
IncuCyte S3 连续成像
该环节要解决的问题是如何在不干扰细胞、不引入终点裂解的前提下，持续追踪同一批样品中迁移与死亡事件的时序关系。IncuCyte S3 以趋化实验模式每 2 h 采集一次图像、持续 48 h，其价值在于时间分辨率足以捕捉迁移速率的动态变化，而无需像传统终点实验那样在每个时间点单独设置复孔。采集覆盖 6 个通道（顶层相差、顶层存活、顶层死亡、底层相差、底层存活、底层死亡），累计 21,312 张原始图像。这类时序图像数据支持后续 ODE 模型拟合——因为迁移率、增殖率与死亡率都需要以时间序列而非单一终点值来估计。
HALO AI 图像分割与分类
该环节要解决的问题是如何把大体量图像转化为可用于建模的细胞计数。HALO AI 图像分析平台对图像进行分割，将细胞分为顶层存活、底层存活与顶层死亡三类。研究用测试数据集将 HALO AI 流程输出与人工计数比较，确认三类细胞检测数量具有良好一致性。这一验证步骤的意义在于：后续 ODE 模型中的三个细胞隔室（顶层存活 Ta、底层存活 Ba、顶层死亡 Td）直接对应这三类计数，若分类不可靠，拟合出的迁移率与死亡率将失去生物学含义。
ODE 模型拟合与参数提取
该环节回答的是：葡萄糖浓度如何定量改变迁移、增殖与死亡速率。ODE 模型描述 Ta 细胞以速率 λT 增殖、以速率 μ 迁移为 Ba 细胞、以速率 δ 死亡成为 Td 细胞。模型被拟合到 0.25、0.5、1、5 和 11.11 mM 五个上室葡萄糖浓度的成像数据。结果显示，随葡萄糖浓度升高，增殖率上升（Pearson R 在 0.76～0.93 之间，p < 0.0001），死亡率下降（Pearson r 在 −0.83～−0.77 之间，p < 0.0001）；而迁移率与葡萄糖浓度呈非单调关系，且 4N 细胞在所有葡萄糖浓度下迁移均快于 3N 细胞。这些定量结果为 S3MB 中双相迁移公式及其参数 vmax 与 bmig（低倍性 0.86 / 高倍性 0.91 1/mM）提供了体外依据。
技术协同
在本研究中，双室体系、IncuCyte S3 与 HALO AI 并非各自独立，而是构成一条从物理约束到图像采集再到定量分类的证据链：双室体系提供可解释的迁移边界，IncuCyte S3 提供时间分辨的原始图像，HALO AI 提供可检验的细胞分类，ODE 模型则把这些计数转化为速率参数。需要注意的是，HALO AI 的分类准确性是用人工计数在一份测试数据集上验证的，这一验证是整条链条成立的前提。
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | 双室培养体系 → IncuCyte S3 | 双室体系设定迁移终点与葡萄糖梯度，IncuCyte S3 在该体系内连续采集上下两室图像 |
| 数据互补 | IncuCyte S3 → HALO AI | IncuCyte S3 提供 6 通道时序图像，HALO AI 将图像转化为三类细胞的定量计数 |
| 方法验证 | HALO AI → 人工计数 | 用测试数据集比较自动分类与人工计数，确认三类细胞检测一致性 |
| 参数传递 | ODE 模型 → S3MB | 体外拟合得到的迁移率差异被用于设定 S3MB 的 vmax 与 bmig，连接体外行为与体内模拟 |
对实验人员来说，这一协同关系的关键在于：活细胞成像提供的是原始图像，图像分析决定计数可靠性，而动力学模型决定这些计数能否被解释为可迁移的速率参数。三者缺一，迁移差异就难以转化为可用于建模的定量结论。
研究组合
该研究的体外部分采用的是一套「活细胞成像 + AI 图像分析 + 动力学建模」的组合。在类似研究中，如果研究目标是量化不同细胞亚群在营养限制下的迁移与增殖差异，可以参考以下组合思路。
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 量化营养梯度下的定向迁移速率 | 双室迁移板 + IncuCyte S3 活细胞成像 | 物理隔室界定迁移终点，时序成像捕捉迁移动态，避免终点实验的单点局限 |
| 区分存活、死亡与迁移细胞 | IncuCyte S3 多通道成像 + HALO AI 图像分割分类 | 将各时间点细胞分为三类，为动力学模型提供对应隔室的输入 |
| 从图像计数中提取速率参数 | ODE 动力学模型 | 把细胞计数转化为增殖率、迁移率与死亡率，便于与更大尺度模型对接 |
| 衔接体外与在体模拟 | 体外 ODE 参数 + S3MB 类空间模型 | 体外得到的迁移差异可作为体内模型迁移参数设定依据 |
适用前提是：研究关注的是营养或代谢底物对细胞迁移、增殖与死亡的影响，且需要时序数据而非单一终点值。边界在于：这套组合给出的是体外速率参数，其向体内迁移依赖模型假设和额外数据；本研究正是用患者 MRI、基因组和病理数据进一步约束模型参数。若研究目的是直接测定临床终点或体内浸润范围，该组合不足以单独回答，需要配合在体成像或空间组学数据。
文献信息
Nowicka Z, Rentzeperis F, Tagal V, 等. Interactions between Ploidy and Resource Availability Shape Clonal Evolution in Glioblastoma. Cancer Research, 2025-04-15. PMID: 39933186. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-24-0401.