原代髓系细胞对核酸和病毒载体高度敏感，长期以来缺乏高效、无筛选标记的基因编辑手段，限制了固有免疫通路发现和药物靶点验证。该研究以小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）、树突状细胞（BMDC）以及人单核细胞来源的巨噬细胞和树突状细胞为对象，采用核转染递送 Cas9-核糖核蛋白（RNP）复合物，通过缓冲液、电转程序、gRNA 化学形式和 RNP 用量的系统筛选，实现了无需选择或富集的接近群体水平基因敲除。流式细胞术、Sanger 测序与 ICE 分析用于量化编辑效率，细胞因子检测、活细胞成像和抗原呈递共培养用于确认编辑过程未显著损害细胞活力、吞噬功能和免疫应答。
实验证据链由三条主线构成：一是以表面或胞内标志物（CD11b、eGFP、CD45、B2M）为读数，通过流式筛选核转染条件；二是以 TLR7、MYD88、TRIF 等通路节点为靶点，通过多基因敲除和配体刺激验证编辑后的功能表型；三是以 Sanger 测序和 ICE 分析独立确认基因组编辑事件。该路线把「递送条件优化—靶基因敲除—免疫功能读出」串联为可复用的原代髓系细胞功能研究方案。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 小鼠 BMDM 与单核细胞核转染条件筛选 | Lonza 4D-Nucleofector 核转染系统（Buffer P3 等 5 种缓冲液、15 种电转程序）、crRNA/tracrRNA-Cas9-RNP | 在维持细胞活力的前提下找到高编辑效率的递送条件 | 细胞活力百分比、CD11b 或 eGFP 平均荧光强度（MFI）、敲除效率热图 |
| 小鼠 BMDC 亚群编辑条件筛选 | Lonza 4D-Nucleofector（Buffer P3、P4、P5 与 CM-137、DS-130、EN-138 等程序）、crRNAXT-Cas9-RNP | 在 Flt3 配体分化的 CD24+ DC、Sirpα+ DC、pDC 和巨噬细胞中实现亚群特异的高效敲除 | CD45 阴性细胞比例、各亚群细胞丰度、CD80 表达水平 |
| 人单核细胞来源巨噬细胞与 DC 编辑 | Buffer P3、CM-137 核转染、crRNA/crRNAXT/sgRNA 与 IDT V3 或 Thermo TruCut V2 Cas9 组合 | 验证跨物种、跨供体、跨 gRNA 化学形式的编辑一致性 | B2M 敲除效率、剂量～反应曲线、细胞活力 |
| 编辑后细胞状态与功能评估 | 流式细胞术（FACSymphony、Fortessa）、ELISA、Luminex、Incucyte S3 活细胞成像 | 确认核转染未广泛激活髓系细胞、未损害吞噬和抗原呈递功能 | CD14、DC-SIGN、HLA-DR、CD69、CD11c、CD80、CD86 表达；TNF、IFNβ、IFNα、IL-12p40、IL-6 分泌；pHrodo 吞噬指数 |
| TLR 通路功能验证 | TLR7、MYD88、TRIF 多基因敲除；R848、PolyI:C、LPS 刺激；Western blot；Sanger 测序与 ICE 分析 | 验证单基因与多基因敲除能否消除特定 TLR 下游细胞因子应答 | TLR7 阴性细胞比例、MyD88/TRIF 蛋白印迹、 indel 频率、细胞因子分泌曲线 |
关键环节
核转染条件筛选是整条证据链的起点。小鼠 BMDM 以 Itgam 编码的 CD11b 为模型靶点，在 5 种缓冲液与 15 种电转程序构成的矩阵中逐一测试，以流式细胞术同时读取细胞活力和 CD11b 平均荧光强度。多数条件表现出毒性，但 Buffer P3 配合程序 CM-137 在维持细胞活力的条件下诱导了显著的 CD11b 表达缺失。随后以 eGFP 转基因小鼠单核细胞为独立验证体系，靶向 eGFP 的 crRNA 再次指向同一条件，说明该递送条件不依赖单一靶点或单一细胞状态。对实验人员来说，这一筛选逻辑的价值在于把「递送毒性」和「编辑效率」作为两个独立读数同时纳入判断，而不是仅以敲除率高低决定条件。
gRNA 形式与组合策略直接影响编辑效率。在 BMDM 和单核细胞来源巨噬细胞中，将两条靶向同一基因的 cr/tracrRNA 混合递送可产生叠加效应，但混合三条并不优于有效的两条组合。在人单核细胞来源巨噬细胞和 DC 中，单独使用高效 gRNA 即可接近 90% 群体水平敲除，两条 gRNA 合并后可超过 90%。化学合成的 sgRNA 相较两步法 crRNA 表现出轻微但一致的效率提升，且可在 2:1 sgRNA:Cas9 摩尔比下保持活性。剂量～反应实验显示，对于活性较低的 sgRNA，RNP 体积减半会导致敲除效率下降 36.5%；加入 4 µM 电转增强剂后，可在减半用量下维持 92.9% 的敲除效率，而高活性 sgRNA 在增强剂存在下可低至 0.125 µl 仍保持接近完全的活性。这些数据支持「先比较单条 gRNA 活性，再决定是否合并及降低用量」的优化顺序。
细胞状态与功能读出用于判断编辑过程本身是否引入混杂表型。在人单核细胞来源巨噬细胞中，核转染后 CD14、DC-SIGN、HLA-DR、CD69 和 CD11c 表面水平与对照相当，CD11b 表达升高，CD86 升高而 CD80 未变，且这些变化与 gRNA 用量无关。TNF 分泌保持低水平，IFNβ 未检出。以 pHrodo 标记的髓鞘碎片和微珠进行活细胞成像，5 小时内吞噬动力学和吞噬指数在各组间相当，且活细胞计数确认起始密度一致。需要注意的是，这些结果提示核转染可引起部分活化标志物的可测量变化，因此非核转染对照和非靶向 gRNA 对照在实验设计中均应保留。
TLR 通路的功能验证把编辑效率转化为生物学结论。在小鼠 Flt3 配体培养的 BMDC 中，针对 Tlr7 的 sgRNA 在 Buffer P3、CM-137 条件下于 CD24+ DC、Sirpα+ DC、pDC 和巨噬细胞中实现依赖 gRNA 内在效率的 TLR7 蛋白减少；pDC 亚群在程序 EN-138 下表现不同。Tlr7 敲除后，R848 刺激诱导的 IFNα、IL-12p40、TNF 和 IL-6 分泌均降低，说明敲除确实阻断了 TLR7 下游应答。在 BMDM 中，Myd88 与 Ticam1/TRIF 的单基因和双基因敲除通过 Western blot 和 Sanger 测序确认，PolyI:C 刺激下 Ticam1/TRIF 敲除足以消除 IFNβ 和 TNF 分泌，LPS 刺激下 Ticam1/TRIF 敲除消除 IFNβ 而 TNF 依赖 MYD88 与 TRIF 的共同信号。这一环节的关键在于，编辑效率数据与配体刺激后的细胞因子数据形成对应关系，使基因敲除与功能缺失之间的因果链得以闭合。
多基因敲除在人单核细胞来源巨噬细胞中得到独立验证。研究选择 B2M、CD14 和 CD81 三个编码表面蛋白的基因，各用一条 sgRNA，通过 Buffer P3、CM-137 递送后在 M-CSF 条件下分化为巨噬细胞。第 6 天流式检测显示单基因、双基因和三基因敲除样本均达到接近完全的群体水平编辑，Sanger 测序与 ICE 分析进一步给出突变等位基因频率。这说明高效单条 sgRNA 可直接组合用于一步法多基因敲除，无需选择标记或稳定表达编辑组件。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 递送条件筛选与标志物读出 | Lonza 4D-Nucleofector 核转染系统、流式细胞术 | 核转染矩阵提供变量，流式同时读取活力和标志物表达，二者共同确定 Buffer P3、CM-137 等条件 |
| 跨物种与跨 gRNA 形式验证 | 小鼠与人原代髓系细胞、crRNA/crRNAXT/sgRNA、不同 Cas9 蛋白 | 同一递送条件在多个体系中复现，sgRNA 与 crRNA 结果互为参照，降低单一体系偏倚 |
| 编辑事件与功能表型的因果连接 | Sanger 测序与 ICE 分析、Western blot、细胞因子检测 | 测序和蛋白印迹确认基因或蛋白缺失，配体刺激后的细胞因子数据确认通路功能缺失 |
| 功能完整性的正交评估 | 流式表型 panel、ELISA/Luminex、Incucyte S3 活细胞成像、T 细胞共培养 | 从表面标志物、分泌因子、吞噬动力学和抗原呈递多个层面判断编辑过程对细胞功能的影响 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 在原代髓系细胞中建立单基因功能缺失模型 | 4D-Nucleofector 核转染系统、流式细胞术、Sanger 测序或 ICE 分析 | 从递送条件筛选到编辑效率定量形成闭环，适用于单核细胞、巨噬细胞和 DC 亚群 |
| 研究 TLR 或固有免疫信号通路节点 | Cas9-RNP 多基因敲除、配体刺激、ELISA 或 Luminex、Western blot | 可比较单基因与双基因敲除后的细胞因子应答差异，适合验证信号通路的冗余或分工 |
| 评估编辑过程对细胞功能的干扰 | 流式表型 panel、活细胞成像（pHrodo 吞噬）、T 细胞增殖共培养 | 将活力、活化状态、吞噬和抗原呈递作为正交读数，减少把编辑副作用误读为基因功能的可能 |
| 跨供体或跨物种比较基因功能 | 人 PBMC 来源单核细胞、小鼠骨髓来源细胞、同一核转染条件、流式定量 | 相同递送条件在不同遗传背景中复现，便于判断表型是否稳健 |
在类似研究中，这套组合的适用前提是能够获得足量的原代髓系细胞，并具备核转染设备和流式检测能力。如果研究目标是筛选大量 gRNA 或进行全基因组水平筛选，还需考虑阵列或混合文库的规模与供体细胞数量；如果关注的是体内应用，则需要另行评估 RNP 递送后的持续性和免疫原性。需要注意的是，文中观察到的 CD11b、CD86 等标志物变化以及部分 DC 亚群丰度改变，提示在解读特定亚群表型时应保留非核转染和非靶向 gRNA 对照。多基因敲除在该研究中最多验证到三个基因，更多重数的可行性取决于每条 sgRNA 的活性和总 RNP 负载。
文献信息
Freund EC, Lock JY, Oh J, Maculins T, Delamarre L, Bohlen CJ, Haley B, Murthy A. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. The Journal of Experimental Medicine. 2020-07-06. PMID: 32357367. DOI: 10.1084/jem.20191692.