内皮细胞在血管稳态中承担屏障、炎症调节及血管平滑肌功能调控等作用，但其内源性 microRNA 在体如何参与血管重构尚不明确。本研究以 Cre/LoxP 系统建立内皮特异性 miR-21 敲除小鼠，围绕主动脉结构与功能重构展开在体评估。实验路线从基因修饰小鼠构建与鉴定出发，依次完成尾套法血压测量、主动脉环开口角测量、离体血管条反应性检测、主动脉灌注固定与组织形态学及弹性/胶原含量分析、P-V 关系检测，并以实时定量 RT-PCR、Western blot 和免疫荧光等方法检测细胞外基质与信号分子表达。
其中，Cre/LoxP 系统与 PCR 基因分型解决内皮特异性基因缺失的构建与鉴定问题；血压测量、开口角测量和 P-V 关系检测分别从在体血流动力学、零应力状态和血管顺应性三个层面反映功能改变；离体血管条反应性检测区分内皮依赖性与非内皮依赖性舒张；组织形态学与生化定量则提供管壁结构及弹性/胶原含量的直接证据。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 内皮特异性 miR-21 敲除小鼠构建与鉴定 | Cre/LoxP 系统、ES 细胞打靶、PCR 基因分型、原位杂交、免疫荧光、实时定量 RT-PCR、半定量 RT-PCR | 实现内皮特异性 miR-21 缺失，并确认缺失发生在 DNA 和 RNA 水平 | PCR 产物条带、miR-21 原位杂交信号、Cre 与 vWF 免疫荧光共定位、miR-21 相对表达量 |
| 在体血压测量 | 可编程尾套法血压计（BP-98A） | 评估内皮 miR-21 缺失对在体血流动力学的影响 | 收缩压、舒张压、平均血压、心率 |
| 主动脉零应力状态评估 | 主动脉环径向切割、显微镜（Olympus SZX16）拍照、Image Pro Plus 6.0 分析 | 反映血管生物力学重构中的零应力状态变化 | 主动脉环开口角（度） |
| 离体血管反应性检测 | 离体主动脉条张力测定、等长张力换能器（RM6240C） | 区分内皮依赖性舒张与非内皮依赖性舒张，评估血管收缩与舒张功能 | 去甲肾上腺素最大张力、乙酰胆碱浓度-舒张曲线、L-NAME 处理后反应、硝普钠浓度-舒张曲线 |
| 主动脉灌注固定与组织形态学分析 | 100 mmHg 压力灌注固定、冰冻切片、H-E 染色、Van Gieson 与 Weigert 染色、显微镜（Olympus BX51）、IPP 6.0 | 评估管壁厚度、内径及弹性/胶原面积占比 | 内半径、外半径、平均半径、壁厚、壁厚/内径比、弹性与胶原染色面积百分比 |
| 弹性与胶原含量生化定量 | Sircol 胶原检测试剂盒、Fastin 弹性蛋白检测试剂盒 | 从生化水平定量主动脉弹性蛋白与胶原含量 | 弹性蛋白含量（µg/mg 湿重）、胶原含量（µg/mg 湿重） |
| 主动脉 P-V 关系检测 | 血管力学性能检测仪（VM-03） | 评估血管顺应性变化 | 压力-容积关系曲线 |
| 细胞外基质与信号分子表达检测 | 实时定量 RT-PCR、Western blot | 验证组织学与生化结果，并探索 Smad、CTGF、MMP/TIMP 等分子变化 | 弹性蛋白、胶原 I、胶原 III mRNA 与蛋白表达量；Smad2/5/7、TGF-β1、CTGF、MMP-2、MMP-10、TIMP-4 蛋白表达量 |
关键环节
内皮特异性 miR-21 敲除小鼠的构建是整个实验路线的基础。研究采用 pBR322 载体构建打靶载体，以 loxP 位点替换 pre-miR 序列（391 bp），两侧分别连接 3.2 kb 和 5 kb 同源臂，并引入由 pGK 启动子驱动的 neo 抗性基因，其两侧为 FRT 位点。打靶载体线性化后电转入 129SvEv 来源 ES 细胞，经 G418 筛选和 PCR 鉴定获得正确同源重组的克隆，注射入 3.5 d C57BL/6 囊胚，获得种系传递后与 Flp 转基因小鼠交配去除 neo 抗性基因，再与 Tek-Cre 转基因小鼠交配，最终获得内皮特异性 miR-21 敲除小鼠。基因分型采用小鼠尾尖消化和 PCR，cF1-cR1 引物可区分野生型（713 bp）、floxed miR-21（925 bp）和 Cre 切除后的 floxed miR-21（427 bp）。这一环节解决的问题是：如何在在体模型中实现内皮特异性的 miR-21 缺失，并通过 PCR 条带组合确认基因型。
miR-21 缺失的确认通过多个层面完成。原位杂交结果显示敲除组内皮细胞中 miR-21 信号显著降低；免疫细胞化学显示这些细胞同时表达内皮标志物 vWF 和 Cre 重组酶；DNA 水平 PCR 显示 miR-21 在内皮细胞中几乎被切除而在全主动脉中仍存在；实时定量 RT-PCR 和半定量 RT-PCR 均显示敲除组内皮细胞 miR-21 表达显著低于对照组。这些数据共同支持内皮特异性 miR-21 敲除小鼠已成功建立，可用于在体功能研究。
在体血压测量采用可编程尾套法血压计，以避免麻醉可能造成的干扰。结果显示敲除组舒张压显著降低至 71.9±3.5 mmHg，而收缩压无显著变化；平均血压也显著降低至 87.4±3.1 mmHg，心率无变化。该环节从在体血流动力学层面提示内皮 miR-21 缺失引起血管功能重构，也引出后续对血管力学与结构改变的检测需求。
主动脉环开口角测量用于评估血管零应力状态。取膈上 10 mm 胸主动脉，剪成 4 段等长环，在无钙 Krebs 液中径向切开，30 分钟后用显微镜拍照，Image Pro Plus 6.0 分析开口角。结果显示敲除组平均开口角为 161.3±13.9°，对照组为 119.1±10.1°，差异显著。开口角增大提示血管残余应力改变，是生物力学重构的重要指标，与弹性蛋白含量下降的结果相互呼应。
离体血管条反应性检测用于区分内皮依赖性与非内皮依赖性舒张功能。主动脉条在 37°C 氧饱和 Krebs 液中平衡后，以 0.3 g 前负荷稳定 60 分钟，用去甲肾上腺素预收缩，再依次加入递增浓度的乙酰胆碱、L-NAME 和硝普钠，通过等长张力换能器记录张力变化。结果显示敲除组去甲肾上腺素最大张力显著降低，乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张受损，L-NAME 可消除两组乙酰胆碱反应，而硝普钠诱导的非内皮依赖性舒张无显著差异。该数据说明内皮 miR-21 缺失损害内皮产生一氧化氮的能力，但血管平滑肌对一氧化氮的反应未受明显影响。
主动脉灌注固定与组织形态学分析解决管壁结构改变的评价问题。主动脉在 100 mmHg 压力下经 0.9% 生理盐水和 4% 多聚甲醛灌注固定，取膈上 0.5 mm 胸主动脉制备 8 µm 冰冻横切面，分别进行 H-E、Van Gieson 和 Weigert 染色，显微镜下采集图像后用 IPP 6.0 分析。结果显示敲除组内半径显著减小，壁厚显著增加，壁厚/内径比显著升高，而外半径无显著变化。Weigert 染色显示弹性蛋白面积百分比下降，Van Gieson 染色未观察到胶原面积百分比的显著变化。这些形态学数据支持内皮 miR-21 缺失引起主动脉中膜增厚和弹性成分减少。
弹性与胶原含量的生化定量通过 Sircol 胶原检测试剂盒和 Fastin 弹性蛋白检测试剂盒完成。结果显示敲除组弹性蛋白含量为 11.6±2.8 µg/mg 湿重，低于对照组的 15.8±1.5 µg/mg；胶原含量为 22.4±1.7 µg/mg 湿重，低于对照组的 25.8±0.9 µg/mg。以胶原/弹性蛋白比值估算主动脉硬度，敲除组显著升高。该环节从生化水平验证了组织学染色提示的细胞外基质成分改变，并提示血管僵硬度增加。
主动脉 P-V 关系检测用于评估血管顺应性。使用血管力学性能检测仪（VM-03）对胸主动脉段进行生理盐水灌注的加载/卸载测试，预适应三次后连续记录三组加载/卸载数据。结果显示敲除组 P-V 关系曲线向下移位，提示在相同压力变化下容积变化减小，即顺应性降低。该数据与胶原/弹性蛋白比值升高、开口角增大共同构成血管力学重构的证据链。
细胞外基质与信号分子表达检测用于验证组织学和生化结果并探索分子机制。实时定量 RT-PCR 和 Western blot 显示敲除组弹性蛋白、胶原 I 和胶原 III 在 mRNA 和蛋白水平均下调，其中胶原 III 在出生后 21 天即显著降低。Western blot 还显示 Smad7 表达上调，Smad2 和 Smad5 表达下调，p-Smad2/5 水平无显著变化；TGF-β1 表达无变化，CTGF 显著升高；MMP-2 和 MMP-10 表达升高，TIMP-4 表达降低。这些分子数据支持 miR-21 缺失通过 Smad7、CTGF 及 MMP/TIMP 途径参与血管重构。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 构建与鉴定 | Cre/LoxP 系统、PCR 基因分型、原位杂交、免疫荧光、实时定量 RT-PCR | Cre/LoxP 实现内皮特异性基因缺失，PCR 和杂交技术从 DNA、RNA 和细胞定位层面确认缺失的特异性和有效性 |
| 功能互补 | 尾套法血压测量、离体血管条反应性检测 | 在体血压反映整体血流动力学状态，离体血管条反应性区分内皮依赖性与非内皮依赖性舒张，共同定位功能损伤环节 |
| 力学与结构互补 | 开口角测量、组织形态学分析、P-V 关系检测 | 开口角反映零应力状态，组织形态学提供管壁几何与成分信息，P-V 关系反映整体顺应性，三者从不同力学层面描述血管重构 |
| 定量验证 | 组织染色图像分析、Sircol 胶原检测、Fastin 弹性蛋白检测、Western blot | 图像分析提供面积占比，生化试剂盒提供含量定量，Western blot 提供蛋白表达水平，三者相互验证细胞外基质改变 |
| 机制关联 | 实时定量 RT-PCR、Western blot | 从 mRNA 和蛋白水平检测 ECM 与 Smad/CTGF/MMP/TIMP 表达变化，将功能与结构表型关联到分子通路 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 建立内皮特异性基因敲除小鼠模型 | Cre/LoxP 打靶载体、ES 细胞电转、PCR 基因分型、原位杂交、免疫荧光 | 实现内皮特异性基因缺失，并从 DNA、RNA 和细胞定位层面验证模型可靠性 |
| 评估在体血流动力学改变 | 尾套法血压计 | 无创获取收缩压、舒张压、平均血压和心率，适合重复测量和活体评估 |
| 评估血管零应力状态与力学重构 | 主动脉环径向切割、显微镜拍照、图像分析软件、血管力学性能检测仪 | 开口角反映残余应力，P-V 关系反映顺应性，两者从不同力学维度描述血管重构 |
| 评估离体血管收缩与舒张功能 | 离体组织浴槽、等长张力换能器、生理信号采集系统 | 区分内皮依赖性与非内皮依赖性舒张，定位功能损伤环节 |
| 评估管壁结构与细胞外基质成分 | 压力灌注固定、冰冻切片、H-E 与特殊染色、显微镜、图像分析软件、生化检测试剂盒、Western blot | 从形态、面积占比、生化含量和蛋白表达多个层面验证细胞外基质改变 |
在类似研究中，若研究目标为评估基因修饰对血管结构与功能的影响，可将血压测量、离体血管反应性检测和 P-V 关系检测作为功能评估组合，将组织形态学、特殊染色和生化定量作为结构评估组合，并以 RT-PCR 和 Western blot 作为分子验证。需要注意的是，这些技术的适用前提是获得稳定遗传的基因修饰小鼠，且离体检测需控制标本取材位置、前负荷和氧合条件。不同血管床对基因缺失的反应可能不同，结果解释需结合具体血管段和动物年龄。
文献信息
Zhang XY, Shen BR, Zhang YC, Wan XJ, Yao QP, Wu GL, Wang JY, Chen SG, Yan ZQ, Jiang ZL. Induction of thoracic aortic remodeling by endothelial-specific deletion of microRNA-21 in mice. PLoS One. 2013. PMID: 23527070. DOI: 10.1371/journal.pone.0059002.