儿科低级别胶质瘤（pediatric low-grade glioma，pLGG）多为 RAS/MAPK 通路单事件驱动，生长缓慢并伴随癌基因诱导的衰老，患者来源细胞系和 PDX 模型常受组织量少、OIS 及额外遗传改变等限制，难以稳定复现肿瘤的分子与细胞异质性。本研究以人 iPSC 来源的前脑类器官为载体，在前脑祖细胞阶段通过电转导入 BRAFV600E 或 KIAA1549::BRAF 表达载体，构建两种 pLGG 类器官模型，并结合免疫荧光、DNA 甲基化芯片、RNA 测序和单细胞 RNA 测序，从蛋白、表观遗传和转录组层面验证其低级别特征、细胞异质性及体内成瘤性。
实验路线以类器官构建与电转为起点，随后依次进行体外表型表征、小鼠原位移植、分子分类和单细胞解析，最后以 tovorafenib 处理评估药物测试可行性。核心仪器与技术包括电穿孔系统、共聚焦显微镜、高内涵成像系统、DNA 甲基化芯片、RNA 测序平台和单细胞 RNA 测序建库与分析流程，各环节产生的数据共同支撑模型与患者低级别胶质瘤的相似性判断。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 前脑类器官构建 | 低吸附 V 底板、悬浮培养、TGFβ 与 Wnt 抑制剂诱导 | 获得含背侧前脑祖细胞、中间祖细胞和胶质祖细胞的人源三维模型 | 类器官形态与分化时点记录 |
| BRAF 突变导入 | Gene Pulser Xcell Eukaryotic System 电穿孔、PiggyBac 转座子系统 | 在前脑祖细胞中稳定表达 BRAFV600E 或 KIAA1549::BRAF，并以 Venus 荧光追踪 | 电转后 Venus+ 细胞比例与活细胞成像 |
| 体外表型表征 | 免疫荧光、共聚焦显微镜、sGAL 染色、ImageXpress Micro Confocal 高内涵成像 | 评估增殖、OLIG2 表达及 p21、p27、p16、sGAL 等衰老标志 | Ki67+、OLIG2+、p21+、p27+、p16+ 细胞定量及 sGAL 图像 |
| 小鼠原位移植 | 立体定位仪、Hamilton 微量注射器、H&E、免疫组化、免疫荧光 | 验证类器官在免疫缺陷小鼠脑内成瘤及低级别特征 | 肿瘤病理分级、GFAP、Ki67、p16、BRAFV600E 染色结果 |
| DNA 甲基化分类 | Infinium Methylation EPIC（850 k）BeadChip、Heidelberg Brain Tumor Classifier、t-SNE | 判断模型是否与低级别胶质瘤实体表观遗传谱更接近 | 甲基化分类结果、校准分数、t-SNE 聚类及拷贝数变异图谱 |
| 转录组与通路分析 | RNA 提取、Agilent 2100 Bioanalyzer、Illumina Novaseq 6000、PCA 与富集分析 | 比较类器官与低级别和高级别胶质瘤组织的整体表达谱 | 差异表达基因数、PCA 分布、衰老与 MAPK 通路富集结果 |
| 单细胞转录组解析 | 10x Genomics、Cell Ranger、Seurat、JointPCA 整合、UMAP | 解析 pLGG 类器官的细胞亚群及其与患者肿瘤细胞状态的对应关系 | 细胞聚类、基因程序富集、OC-like、AC-like 与 MAPK 特征簇 |
| 药物处理评估 | tovorafenib 处理、免疫荧光、Western blot、IncuCyte S3 活细胞分析系统 | 评估模型对 pan-RAF 抑制剂的反应性及药物测试适用性 | Ki67 与 Cleaved Caspase 3 定量、p-ERK/ERK 比值、A375 细胞 EC50 |
关键环节
类器官构建与电转是模型建立的起点。研究采用已报道的人前脑类器官生成方案，在第 35 天和第 77 天两个分化时点进行电转，此时类器官分别以 SOX2+ 放射状胶质细胞、TBR2+ 中间祖细胞和 TBR1+/TUBB3+ 深层神经元为主，或已出现更多 TBR2+ 祖细胞、SATB2+ 神经元和少量 OLIG2+ 少突胶质谱系细胞。电转使用 Gene Pulser Xcell Eukaryotic System，配合 PiggyBac 转座子系统实现稳定表达，并通过 IRES Venus 荧光追踪阳性细胞。第 35 天电转条件为 100 V、10 ms、5 次脉冲、0.1 s 间隔、2 mm 电转杯、100 µg DNA；第 77 天电转为 200 V、10 ms、5 次脉冲、0.1 s 间隔、4 mm 电转杯、200 µg DNA。电转后 15～70 天活细胞成像显示 Venus+ 细胞逐步增加，70 天时类器官几乎完全由 Venus+ 细胞组成，为后续表型与分子分析提供了稳定的突变细胞群。
体外表型表征环节用于判断 BRAF 驱动的类器官是否呈现 pLGG 的低增殖与衰老特征。免疫荧光和共聚焦显微镜定量显示，BRAFV600E 与 KIAA1549::BRAF 类器官未在电转后 30 天出现 Ki67+ 细胞显著升高，而 TPR-MET + p53R273C 高级别胶质瘤模型则增殖明显增强；至电转后 70 天，各组 Ki67+ 比例趋于接近。BRAF 类器官中 OLIG2+ 细胞水平与对照相当，与患者星形细胞肿瘤中广泛表达 OLIG2 的报道一致。同时，BRAF 类器官出现较多 p21+ 和 p27+ 细胞，并在电转后 70 天检测到 p16INK4a 与 sGAL 活性，而对照类器官几乎不表达，提示 BRAF 通路激活诱导了生长阻滞与衰老程序。这些数据构成模型具有 pLGG 相关低级别表型的第一层证据。
小鼠原位移植用于验证体内成瘤性。研究将电转后 70 天的类器官经立体定位注射至 Foxn1nu/nu 免疫缺陷小鼠右侧脑室，每只小鼠接受 2～3 个类器官，使用 26 s-gauge Hamilton 微量注射器，坐标以 lambda 为参照为 −1.5 D/V、+1.2 M/L、+1.5 A/P。移植三个月后，脑组织切片显示 Venus+ 细胞形成小簇，表达 BRAFV600E、OLIG2、p21、p27、Ki67 和 p16；组织学检查在所有分析样本中均发现肿瘤性病变，其中 BRAFV600E 组多数表现为低级别特征，KIAA1549::BRAF 组部分表现为低级别、部分为高级别或中间级别。GFAP 阳性提示星形细胞分化，Ki67 指数用于区分级别。与高级别胶质瘤模型相比，BRAF 类器官形成的肿瘤更小、侵袭性更低，支持其复现 pLGG 体内行为。
DNA 甲基化芯片与转录组分析构成分子分类证据。研究使用 Infinium Methylation EPIC（850 k）BeadChip 对移植后肿瘤样本进行全基因组甲基化谱分析，经 Heidelberg Brain Tumor Classifier 分类，所有样本均归为 Infant-type Hemispheric Glioma（IHG），校准分数大于 0.8。t-SNE 分析显示，类器官样本形成独立紧凑簇，更靠近低级别胶质瘤实体而非高级别肿瘤，并与 BRAF 突变弥漫中线胶质瘤存在部分表观遗传重叠。RNA 测序在 Illumina Novaseq 6000 平台上完成，PCA 显示类器官与儿科低级别胶质瘤组织接近，与高级别胶质瘤分离；差异表达基因分析中，低级别与高级别组织比较得到 8200 个差异基因，低级别与高级别细胞模型比较得到 10 193 个差异基因，其中 5949 个共享，通路富集指向细胞衰老和 MAPK 程序。甲基化衍生的拷贝数变异图谱呈平坦型，未提示染色体改变，与低级别组织学一致。
单细胞 RNA 测序用于解析细胞异质性。研究对 D77 + 70 和 D77 + 214 两个时点的类器官进行 10x Genomics 单细胞建库和测序，经 Cell Ranger 比对和 Seurat 分析，并与 6 例携带 KIAA1549::BRAF 的毛细胞星形细胞瘤患者单细胞数据整合。结果显示，类器官来源细胞与患者毛细胞星形细胞瘤细胞紧密聚类，且不受时点或突变类型影响；细胞可对齐到少突胶质细胞样（OC-like）、星形细胞样（AC-like）和 MAPK 信号特征簇，并进一步注释到肿瘤性星形细胞、肿瘤性细胞和肿瘤性内皮细胞。这一结果说明模型可产生至少三种转录状态不同的肿瘤细胞亚群，与患者肿瘤的细胞异质性相近。
tovorafenib 处理用于评估模型在药物测试中的适用性。研究对 D77 + 300 或 D77 + 320 的类器官给予 1 µM tovorafenib 或 DMSO 处理 7 天，免疫荧光定量 Ki67 和 Cleaved Caspase 3，Western blot 检测 p-ERK/总 ERK 比值。结果显示，tovorafenib 未显著改变细胞增殖或凋亡，仅 BRAFV600E 类器官中 p-ERK 略有下降，KIAA1549::BRAF 类器官无变化。作为对照，A375 黑色素瘤细胞在 IncuCyte S3 活细胞分析系统中表现出剂量依赖性凋亡，EC50 为 5.79 µM。作者指出，该模型在当前条件下未显示 tovorafenib 敏感性，可能与药物穿透有限、化合物稳定性或短期体外暴露难以复现临床延迟反应有关，因此更适合作为探索性、假设生成平台，而非独立的预测性药筛系统。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | 电穿孔系统、PiggyBac 载体、活细胞成像 | 电转完成突变导入，Venus 荧光追踪阳性细胞扩增，为后续表型与组学分析提供细胞来源 |
| 互补验证 | 免疫荧光、sGAL 染色、Western blot | 从蛋白表达、酶活性和信号通路磷酸化水平互补判断衰老与 MAPK 通路状态 |
| 体内外印证 | 类器官体外培养、小鼠原位移植、H&E 与免疫组化 | 体外低增殖与衰老表型在体内成瘤后被组织学和 Ki67 指数进一步验证 |
| 分子分类支撑 | DNA 甲基化芯片、Heidelberg 分类器、RNA 测序 | 甲基化谱确定表观遗传归属，转录组谱补充表达层面相似性，共同支持模型的低级别属性 |
| 单细胞解析 | 单细胞 RNA 测序、Seurat、JointPCA 整合 | 在群体水平分类基础上解析细胞亚群，揭示与患者肿瘤对应的 OC-like、AC-like 和 MAPK 特征 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 构建突变驱动的人源脑肿瘤类器官 | iPSC 前脑类器官培养体系、Gene Pulser Xcell 电穿孔系统、PiggyBac 稳定表达载体、荧光活细胞成像 | 在三维人源神经组织中导入特定驱动突变并追踪阳性细胞，适用于需要稳定表达癌基因的模型构建 |
| 验证模型的低级别与衰老表型 | 共聚焦显微镜、免疫荧光抗体 panel（Ki67、OLIG2、p21、p27、p16）、sGAL 染色 | 从增殖、谱系和衰老多个维度判断模型是否呈现低级别胶质瘤特征 |
| 评估体内成瘤性与病理级别 | 立体定位仪、Hamilton 微量注射器、H&E、免疫组化、免疫荧光 | 在免疫缺陷小鼠中验证成瘤能力，并通过 Ki67 指数和 GFAP 等标志进行级别判断 |
| 进行表观遗传和转录组分类 | Infinium Methylation EPIC 芯片、Heidelberg Brain Tumor Classifier、RNA 测序、PCA 与富集分析 | 从甲基化和表达谱两个层面判断模型与患者肿瘤实体的相似程度 |
| 解析细胞异质性与亚群状态 | 10x Genomics 单细胞建库、Cell Ranger、Seurat、JointPCA、UMAP | 识别类器官中的肿瘤细胞亚群，并与患者单细胞数据比对，评估异质性保真度 |
需要注意的是，上述组合的适用前提是具备人 iPSC 前脑类器官培养和电转条件，并能获得足够的类器官样本用于组学分析。由于该模型缺乏免疫细胞和血管系统，在肿瘤微环境相关研究中不宜单独作为完整模型使用；在药物测试中，短期体外暴露可能无法复现临床延迟反应，更稳妥的做法是结合药代动力学、延长处理时间或纵向检测，并明确其当前定位为探索性、假设生成平台。
文献信息
Leva G, Santomaso L, Gianesello M, 等. Modeling pediatric low-grade glioma heterogeneity using human forebrain organoids. Molecular Cancer, 2026. PMID: 41923199. DOI: 10.1186/s12943-026-02612-x.