牙髓坏死导致年轻恒牙失去功能性牙髓组织，根管治疗后牙齿强度下降、再感染风险增加。再生牙髓治疗旨在恢复牙髓-牙本质复合体的天然结构与功能，其中支架材料是决定疗效的关键因素。本研究以比格犬原位牙髓再生模型为平台，将猪源脱细胞牙髓基质水凝胶（pDDPM-G）分别以三种策略引入根管：负载牙髓干细胞（DPSC）移植、诱导出血后注射、以及材料单独注射用于细胞归巢。实验采用微CT评估手术前后根尖发育与根管内钙化程度，结合组织学染色和免疫荧光分析在术后 14 天与 90 天对牙本质生成、血管生成和神经生成相关标志物进行定量，形成从影像学到分子标记的多层次证据链。
该研究的核心方法学价值在于：微CT提供了根长、根尖孔闭合和弥漫性钙化的三维定量数据，免疫荧光则通过 DSPP、DMP1、CD31、KDR、MAP2、TUJ1 等标志物在细胞定位和表达强度层面验证再生组织的功能成熟度。两者互补，使支架材料在根管内复杂环境中的实际贡献能够被客观区分。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立与分组 | 比格犬原位牙髓再生模型；橡胶障隔离；K锉根管预备；根尖定位仪 | 在真实根管环境中比较 pDDPM-G 三种应用策略与对照组的再生效果 | 7 组分组方案（NC、pDDPM-G+DPSCs、BI+pDDPM-G、pDDPM-G、BI+COL I、COL I、BI）；共 55 个根管 |
| 术前与术后影像采集 | 便携式 X 线机（S01, Eighteeth）；微CT（μCT 50, SCANCO Medical AG；90 kV、200 μA、360 度旋转、像素尺寸约 24.2 μm） | 评估根尖发育状态、根长变化及根管内弥漫性钙化比例 | 根尖片与 CT 图像；根长定量数据；钙化体积与根管总体积比值 |
| 组织学染色 | 石蜡切片；H&E 染色；Masson 三色染色；玻片扫描仪（Leica） | 观察根管内新生组织的形态、胶原分布、血管样结构和成牙本质细胞样层 | 新生组织面积与根管面积比值；血管数量统计 |
| 免疫荧光分析 | 抗原修复；一抗孵育（DSPP、DMP1、CD31、KDR、MAP2、TUJ1）；DyLight 488/594 二抗；DAPI 核染；共聚焦显微镜（FV3000, Olympus） | 定量成牙本质细胞样、血管内皮和神经样细胞标志物的表达强度与空间分布 | 平均荧光强度（MFI）；标志物阳性细胞分布图像 |
| 图像与统计分析 | ImageJ 软件；GraphPad Prism 9.0；ANOVA | 量化影像与荧光数据，比较组间差异 | MFI 均值与标准差；组间统计学差异（p < 0.05） |
关键环节
原位牙髓再生模型的建立是整个证据链的起点。研究选用 6 月龄雄性比格犬，其恒牙根尖孔未闭合，与临床年轻恒牙牙髓坏死的解剖条件相近。手术在全身麻醉下进行，使用橡胶障隔离术区，以 #10 至 #70 K 锉逐步扩大根管并将根尖孔扩大至 0.7 mm，随后以 3% 次氯酸钠、生理盐水和 17% EDTA 冲洗。根尖定位仪用于确定工作长度，并参考术前 CT 影像。这一环节决定了后续影像与组织学数据能否在标准化根管条件下进行组间比较。
微CT承担了影像学评价的核心任务。术前 2 天采集基线螺旋 CT，术后 14 天和 90 天分别采集根尖片和微CT图像。μCT 50 系统以 90 kV、200 μA、360 度旋转和约 24.2 μm 像素尺寸扫描颌骨标本，XLaunch 软件进行三维重建。根长定义为颊侧和舌侧壁从釉牙骨质界到根尖的平均距离。弥漫性钙化比例通过手动勾画根管边界后调整阈值识别阻射区域并自动计算。结果显示，术后 90 天所有组根长均显著增加且根尖孔闭合，但各组间根长无统计学差异；含血诱导的 BI 组和 BI+COL I 组根管内钙化体积较高，而同样含血诱导的 BI+pDDPM-G 组钙化体积较低。这一对比直接支持 pDDPM-G 可减少根管内钙化这一结论。
组织学染色用于确认新生组织的形态学特征。标本经 10% EDTA 脱钙 6 个月后石蜡包埋，沿根轴纵向切取 5 μm 切片，分别进行 H&E 和 Masson 三色染色，玻片扫描仪采集图像。ImageJ 用于计算根管面积、新生组织面积和血管数量。术后 90 天，pDDPM-G 注射组（pDDPM-G+DPSCs、BI+pDDPM-G、pDDPM-G）根管内新生组织表现为排列良好的纤维和血管样结构，且在靠近牙本质壁处可见成牙本质细胞样层；不含 pDDPM-G 的组则出现广泛骨样组织沉积或弥漫性钙化，牙髓-牙本质复合体和新生血管化少见。
免疫荧光分析提供了分子层面的功能验证。切片经柠檬酸-EDTA 抗原修复、Triton X-100 通透和 BSA 封闭后，分别与 DSPP、DMP1、CD31、KDR、MAP2、TUJ1 一抗 4°C 孵育过夜，再以 DyLight 488 抗小鼠和 DyLight 594 抗兔二抗室温孵育 1 小时，DAPI 染核。共聚焦显微镜在固定激光强度下以 20 倍放大采集每张切片至少 5 个随机视野，ImageJ 计算平均荧光强度。术后 14 天，pDDPM-G+DPSCs 和 BI+pDDPM-G 组的 DSPP+ 和 DMP1+ 表达已优于 BI+COL I 和 BI 组；术后 90 天，含 pDDPM-G 的三组不仅在根管内显示大量 DSPP+ 和 DMP1+ 信号，还可见少量 DSPP+ 细胞穿透牙本质小管，而 BI+COL I、COL I 和 BI 组仅见散在或极少表达。血管标志物 CD31 和 KDR 在术后 90 天以 pDDPM-G+DPSCs 组最为丰富，与 NC 组接近；BI 组在 90 天时仅见零星表达。神经标志物 MAP2 和 TUJ1 在术后 14 天各组均较少，90 天时 pDDPM-G+DPSCs 和 BI+pDDPM-G 组表达接近 NC 组水平，BI+pDDPM-G 组中 TUJ1+ 细胞主要位于新生组织中心，MAP2+ 细胞分布于中央和外周区域，而 pDDPM-G+DPSCs 组中 MAP2+ 和 TUJ1+ 细胞空间分布较为随机。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | 微CT → 组织学染色 → 免疫荧光 | 微CT在活体或固定标本上提供根尖发育和钙化的整体影像，组织学染色在切片层面确认新生组织的形态和细胞排列，免疫荧光进一步在分子水平定量特定标志物的表达，三者按时间点和组织层次逐步深入 |
| 互补验证 | 微CT 与组织学染色 | 微CT显示 BI 和 BI+COL I 组根管内钙化体积较高，组织学染色显示这些组出现广泛骨样组织沉积或弥漫性钙化，两种方法从影像密度和组织形态两个角度共同支持 pDDPM-G 抑制异位矿化的结论 |
| 独立佐证 | 免疫荧光（DSPP/DMP1、CD31/KDR、MAP2/TUJ1） | 三类标志物分别反映成牙本质细胞样分化、血管内皮和神经样细胞再生，在含 pDDPM-G 组中均显示较高表达，表明该支架材料同时支持多条功能分化路径 |
| 时间维度验证 | 14 天与 90 天两个时间点 | 早期（14 天）以 BI+pDDPM-G 组的血管和神经再生较为突出，后期（90 天）以 pDDPM-G+DPSCs 组的组织成熟度和血管化程度更接近天然牙髓，提示不同再生策略在时间维度上各有优势 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 评价支架材料对根尖发育和矿化的影响 | 便携式 X 线机 + 微CT（含三维重建软件） | X 线片提供二维整体视图，微CT提供根长、根尖孔和钙化体积的精确三维定量，适合需要区分再生与异位矿化的研究 |
| 确认再生组织的形态和细胞排列 | 石蜡切片 + H&E/Masson 染色 + 玻片扫描仪 + ImageJ | 在组织层面观察新生组织面积、胶原分布和血管样结构，为后续免疫荧光提供定位参考 |
| 定量特定功能标志物的表达 | 共聚焦显微镜 + 多色免疫荧光（一抗/二抗/DAPI）+ ImageJ MFI 分析 | 在同一组织切片上同时或连续标记多个标志物，通过平均荧光强度进行组间半定量比较，适合需要评估多种分化方向的研究 |
| 比较不同再生策略的时效特征 | 至少两个时间点的影像采集 + 组织学 + 免疫荧光 | 早期时间点反映细胞募集和血管化启动，后期时间点反映组织成熟和功能重建，有助于区分不同策略的优势窗口 |
上述仪器组合的适用前提是具备标准化动物模型和可重复的切片/染色流程。需要注意的是，微CT钙化定量依赖手动勾画根管边界和阈值调整，不同操作者之间可能存在差异；免疫荧光 MFI 比较要求同批切片、相同激光强度和放大倍数下采集。如果研究目标侧重于某一种再生机制（如仅关注血管化），可适当减少标志物数量而增加时间点密度，但需在实验设计阶段权衡样本量和统计效能。
文献信息
Liang Z, Feng Y, Zhang S, et al. Decellularized Dental Pulp Matrix Hydrogel Promotes Functional Endodontic Regeneration In Situ. International Endodontic Journal, 2026, 59: 1680. PMID: 41872666. DOI: 10.1111/iej.70148.