肾近端小管细胞（PTC）高表达巨蛋白（megalin，即 LRP2），该受体通过内吞作用参与多种配体的重吸收，并被认为与肾素-血管紧张素系统及动脉粥样硬化相关。本研究旨在确定 PTC 特异性巨蛋白缺失是否减轻高胆固醇血症诱导的动脉粥样硬化。研究采用 Ndrg1-CreERT2 与 Lrp2 floxed 小鼠杂交，在他莫昔芬诱导下构建 PTC-LRP2 −/− 小鼠，并在 LDL 受体 −/− 或 LDL 受体 +/+ 背景下以 12 周西式饮食或普通饲料饲养。模型经 DNA-PCR、qPCR、免疫组化及 Western blot 验证后，通过活体多光子显微镜量化 PTC 对荧光标记清蛋白的摄取功能，辅以组织病理染色、尿液 ELISA 和 bulk RNA 测序，发现 PTC 特异性巨蛋白缺失不影响动脉粥样硬化，但在雄性小鼠中诱发西式饮食依赖的肾小管间质肾炎（TIN）。
研究路线体现了从基因型鉴定、蛋白与 mRNA 表达验证，到功能成像、病理形态评估和转录组分析的多层证据链。活体多光子显微镜在建模后短期内直接展示 PTC 对清蛋白的摄取缺陷，RNA 测序则从转录水平提示炎症相关通路激活，两者与组织病理结果相互印证，共同确认了模型表型。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 条件敲除小鼠构建与基因型鉴定 | Ndrg1-CreERT2 与 Lrp2 floxed 小鼠杂交；他莫昔芬腹腔注射；DNA 提取与 PCR | 确认 Cre 重组及 Lrp2 等位基因在 PTC 中的可诱导缺失 | Cre 基因型、floxed 等位基因 PCR 产物 |
| 肾脏巨蛋白缺失的分子验证 | qPCR；Western blot；免疫组化（自动化染色系统 Xmatrx® Infinity）；Zeiss Axioscan Z1 或 7 扫描 | 量化 Lrp2 mRNA 与巨蛋白丰度，确认 S1/S2 段缺失及 S3 段保留 | Lrp2 mRNA 相对丰度、巨蛋白免疫印迹条带、肾皮质与髓质免疫组化图像 |
| 肾功能与配体排泄检测 | 代谢笼或 LabSand 尿液收集；ELISA；质谱辅助尿液蛋白质组学 | 评估巨蛋白内吞功能受损后多种配体在尿液中的排泄变化 | 尿 AGT、renin、RBP4、albumin、NGAL、KIM-1 浓度；尿液蛋白质组分子列表 |
| 活体清蛋白摄取功能成像 | Texas Red 标记大鼠血清清蛋白；活体多光子显微镜 | 在完整肾脏中实时量化 PTC 对清蛋白的摄取速率 | 注射前及注射后 10、30、60 分钟的三维荧光图像与摄取定量数据 |
| 组织病理与炎症细胞评估 | H&E 染色；PAS 染色；Picrosirius red 染色；CD68、CD45、CD3、CD19 免疫组化；Zeiss Axioscan Z1 或 7 | 确认肾小管萎缩、间质炎症细胞浸润、纤维化及肾小球损伤程度 | 肾脏大体形态与重量、H&E 与 PAS 图像、CD68 阳性细胞分布、胶原面积分数 |
| 转录组机制分析 | bulk RNA 测序（Novogene，NEBNext Ultra™ RNA Library Prep Kit，NovaSeq 6000，paired-end）；STAR 比对与 HTSeq 定量；edgeR 与 clusterProfiler 分析 | 揭示早期与慢性阶段肾脏基因表达变化及炎症、胶原相关通路激活 | 差异表达基因列表、PCA 图、火山图、GO 富集结果、炎症与胶原基因热图 |
| 动脉粥样硬化表型评估 | 尾套血压系统（BP-2000）；血浆总胆固醇酶法检测；en face 主动脉病变面积定量（Nikon DS-Ri1 相机与 NIS-Elements 软件） | 判断 PTC 特异性巨蛋白缺失是否影响血压、血脂及动脉粥样硬化 | 收缩压、血浆总胆固醇、主动脉病变面积百分比 |
关键环节
模型构建首先依赖 Ndrg1-CreERT2 与 Lrp2 floxed 小鼠的杂交策略。Lrp2 floxed 小鼠在外显子 72～74 两侧引入 LoxP 位点，与 Ndrg1-CreERT2 小鼠交配后获得 PTC-LRP2 +/+ 与 PTC-LRP2 −/− 同窝仔鼠。4～6 周龄小鼠连续 5 天腹腔注射他莫昔芬（150 mg/kg/day）以诱导 Cre 核转位，停药 2 周后开始西式饮食或普通饲料饲养。该策略使 Cre 重组局限于 NDRG1 蛋白高表达的肾皮质 PTC S1 和 S2 段。
基因型与缺失验证通过 DNA-PCR、qPCR、免疫组化和 Western blot 完成。DNA-PCR 分别使用肾皮质（COR）和髓质（MED）组织，确认 floxed 等位基因的 Cre 依赖性删除。qPCR 显示 PTC-LRP2 −/− 小鼠肾脏 Lrp2 mRNA 降低约 80%。免疫组化使用自动化染色系统 Xmatrx® Infinity 完成，图像经 Zeiss Axioscan Z1 或 7 扫描采集，显示巨蛋白在 S1 和 S2 段缺失，而 S3 段仍保留。Western blot 以 GAPDH 为内参，进一步确认巨蛋白蛋白水平下降，同时检测 cubilin 未出现代偿性升高。这些数据共同确认了模型在目标节段的特异性缺失，并保留了 S3 段巨蛋白表达。
肾功能与配体排泄评估用于验证巨蛋白内吞功能受损。尿液经代谢笼或 LabSand 收集，ELISA 检测显示 PTC-LRP2 −/− 小鼠尿中 AGT、renin、RBP4、NGAL 和 KIM-1 显著升高，尿清蛋白/肌酐比值增加。质谱辅助尿液蛋白质组学在建模后、西式饮食前即检测到多种巨蛋白配体排泄增加，包括 AGT、RBP4、LPL 和 LCN2，其中 REN1 仅在 PTC-LRP2 −/− 小鼠尿中检出。这些结果提示巨蛋白作为 PTC 内吞受体功能受损，并支持后续表型分析。
活体多光子显微镜是功能验证的核心环节。在西式饮食饲养 10 天后，雄性 PTC-LRP2 +/+ 与 PTC-LRP2 −/− 小鼠经静脉注射 Texas Red 标记大鼠血清清蛋白（TR-RSA），在注射前及注射后 10、30、60 分钟采集肾脏三维图像。定量分析显示 PTC-LRP2 −/− 小鼠初始摄取速率降低约 47 倍，且注射前图像中 PTC 溶酶体自发荧光明显减少，提示其他内源性配体摄取可能同样下降。该数据在完整肾脏中直接证明巨蛋白缺失导致 PTC 清蛋白摄取功能严重缺陷，与尿液标志物升高一致。
组织病理与炎症细胞评估用于确认 TIN 表型。H&E 染色显示雄性 PTC-LRP2 −/− 小鼠肾皮质和外髓质出现肾小管萎缩及间质细胞聚集；CD68 和 CD45 免疫组化显示间质巨噬细胞浸润，而 CD3 和 CD19 染色未显示明显 T 细胞或 B 细胞聚集。Picrosirius red 染色显示纤维化区域与巨噬细胞聚集区域空间重合；PAS 染色未发现明显肾小球损伤。这些病理特征符合 TIN 表现。雌性 PTC-LRP2 −/− 小鼠及普通饲料饲养的雄性小鼠未见明显病理改变，提示表型依赖西式饮食和性别。
转录组分析用于探索机制。对西式饮食饲养 2 周和 12 周的雄性小鼠肾皮质进行 bulk RNA 测序，PCA 显示两种基因型转录组明显分离；差异表达分析发现 2959 个基因上调、2582 个基因下调。GO 富集分析显示上调基因主要富集于炎症相关通路，Il6、Lcn2、Il1b、Tnf、Ccl2 和 Stat1 等炎症分子以及多个胶原基因表达升高。这些转录组变化在 12 周时仍然存在，与组织病理中早期炎症和纤维化表现一致，提示炎症可能是 TIN 发生的早期事件。
动脉粥样硬化表型评估显示，PTC 特异性巨蛋白缺失未减轻 LDL 受体 −/− 小鼠的动脉粥样硬化病变，而全身性 Lrp2 ASO 处理仍显著抑制病变。血浆总胆固醇和收缩压在组间无差异。该结果说明 PTC 来源巨蛋白缺失与全身性巨蛋白抑制在动脉粥样硬化中的作用不同，并提示肾脏病理可能独立于高胆固醇血症。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 构建与验证 | Ndrg1-CreERT2 杂交、他莫昔芬诱导、DNA-PCR、qPCR、免疫组化、Western blot | 基因编辑构建模型，分子与蛋白检测验证目标节段缺失，形成模型成立的证据基础 |
| 功能与结构互补 | 活体多光子显微镜、尿液 ELISA、H&E/PAS/PSR 染色、免疫组化 | 多光子显微镜在活体水平展示清蛋白摄取缺陷，尿液标志物反映内吞功能受损，组织病理确认结构损伤与炎症浸润 |
| 表型与机制衔接 | 组织病理、bulk RNA 测序、GO 富集分析 | 病理观察提供表型定位，RNA 测序提供炎症和纤维化相关转录证据，两者在时间与空间上相互印证 |
| 干预对照 | Lrp2 ASO 处理、PTC-LRP2 −/− 模型 | ASO 全身性抑制与遗传性节段缺失形成对照，用于比较不同巨蛋白抑制方式对动脉粥样硬化和肾脏表型的影响 |
活体多光子显微镜与 RNA 测序在本研究中形成功能与机制的双重证据。多光子显微镜在建模后短期内即检测到清蛋白摄取速率急剧下降，RNA 测序则在相同时间点显示炎症通路激活，两者结合提示摄取功能缺陷可能早于或伴随炎症发生。组织病理中 CD68 阳性细胞浸润和胶原沉积与转录组中炎症和胶原基因上调一致，进一步支持 TIN 表型的真实性。
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 构建并验证肾小管节段特异性基因敲除模型 | Ndrg1-CreERT2 或类似节段特异性 Cre 工具鼠、他莫昔芬诱导、DNA-PCR、qPCR、免疫组化、Western blot | 实现可诱导、节段限制的基因缺失，并通过多层级分子验证确认缺失范围与残余表达 |
| 在活体水平评估肾小管受体功能 | 荧光标记配体、活体多光子显微镜 | 在完整肾脏中实时量化摄取动力学，避免离体实验对组织结构和微环境的干扰 |
| 评估饮食诱导的肾脏炎症与纤维化表型 | H&E、PAS、Picrosirius red 染色、CD68/CD45 免疫组化、自动染色系统与全片扫描仪 | 提供组织形态、炎症细胞浸润和胶原沉积的空间信息，支持 TIN 病理诊断 |
| 探索表型相关转录机制 | bulk RNA 测序、差异表达分析、GO 富集分析 | 在早期和慢性阶段识别炎症、纤维化相关通路变化，为后续机制研究提供候选基因和通路 |
| 评估心血管表型与肾功能的关系 | 尾套血压系统、血浆胆固醇检测、en face 主动脉病变定量 | 区分肾脏表型与全身性动脉粥样硬化、血压和血脂变化的关系 |
在类似研究中，若研究目标是解析肾小管特定节段受体在饮食诱导肾损伤中的作用，可参考「节段特异性 Cre 工具鼠 + 他莫昔芬诱导 + 分子验证 + 活体多光子显微镜 + 组织病理 + RNA 测序」的组合。需要前提是目标基因存在可用的 floxed 小鼠和节段特异性 Cre 工具；活体多光子显微镜需要合适的荧光配体和稳定的静脉注射方案；RNA 测序需设置足够生物学重复并在早期和慢性时间点分别采样。边界在于，该组合不能直接区分 S1/S2 缺失与 S3 残留巨蛋白各自对表型的贡献，若需进一步定位，可能需要 S3 特异性 Cre 工具或单核 RNA 测序结合空间转录组学。
文献信息
Amioka N, Franklin MK, Kukida M, 等. Renal Proximal Tubule Cell-Specific Megalin Deletion Does Not Affect Atherosclerosis But Induces Tubulointerstitial Nephritis in Mice Fed a Western Diet. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2025. PMID: 39569521. DOI: 10.1161/ATVBAHA.124.321366.