骨髓增生异常综合征（MDS）的疾病生物学研究长期受限于缺乏可靠体内模型，尤其是患者样本量有限时，难以在免疫缺陷小鼠中实现原发性MDS干细胞的稳定长期植入。该研究以明胶基多孔支架为载体，先种植人源骨髓间充质基质细胞（MSC）构建人源化微环境，再植入含MDS干细胞的骨髓单核细胞，最终皮下移植至NSG或NSG-SGM3小鼠。整个流程中，流式细胞术承担植入效率与谱系分布的定量，免疫荧光和H&E承担细胞空间分布与病态形态观察，靶向DNA测序确认突变克隆保留，高分辨率超声成像在活体条件下验证支架血管灌注状态。
该模型的构建逻辑在于，将人源MSC与MDS造血干/祖细胞的相互作用置于可回收、可成像的异位支架中，从而在体内形成人源微环境并支持MDS干细胞归巢与自我更新。超声成像提供支架在体内的灌注证据，与离体流式、组织学和测序数据共同构成从活体功能到细胞表型再到分子克隆的验证链条。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 人源MSC的分离与扩增 | Ficoll-Paque PLUS密度梯度离心、EasySep磁珠分选（CD45阳性选择）、MSC培养基及37°C、5% CO₂培养箱 | 获得足量、可扩增的人源MSC用于支架预种植 | MSC扩增水平、表面标志物及培养状态 |
| 明胶支架制备与MSC种植 | Gelfoam可吸收明胶海绵切割、胰岛素注射器接种、超低吸附多孔板、37°C、5% CO₂培养箱 | 在三维支架中构建人源骨髓基质层 | MSC种植量（约5×10⁴～1×10⁵/支架）、支架内基质层形成 |
| MDS造血干/祖细胞植入支架 | EasySep CD3阳性选择、CD34阳性选择、FACS分选CD34⁺CD38⁻细胞、MyeloCult H5100培养基及细胞因子（G-CSF、IL3、TPO） | 以尽可能少的CD34⁺细胞实现原代MDS干细胞装载 | CD3⁻MNC或CD34⁺CD38⁻细胞的接种数量与组分 |
| 支架皮下移植 | NSG/NSG-SGM3/NSGW41小鼠、铯-137亚致死剂量照射（375 cGy）、异氟烷麻醉、无菌手术操作、手术缝合夹 | 在免疫缺陷小鼠体内建立异位人源化微环境 | 移植存活率、支架回收时间（12～18周或更久） |
| 支架灌注活体成像 | Vevo 3100超声系统、MX550D探头、Vevo MicroMarker非靶向造影剂、尾静脉导管与Vevo输注泵 | 在活体、无创条件下判断支架是否完全灌注及血管化 | 非线性对比增强超声信号、微泡通过支架血管的动态影像 |
| 支架组织学与免疫荧光分析 | 10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋、5 μm切片、热抗原修复、Zeiss Axio Scan Z1切片扫描仪及Zen blue软件 | 观察人CD45⁺细胞空间分布、鼠血管结构关系及病态粒细胞形态 | H&E染色形态、人CD45与Endomucin免疫荧光图像 |
| 支架组织消化与流式分析 | Dispase、I型胶原酶、DNase I组织消化液、37°C水浴、Fortessa流式细胞仪、FACS Aria SORP分选仪 | 定量人源细胞植入比例、谱系分布及干/祖细胞表型 | hCD45⁺、hCD33⁺、hCD19⁺、hCD3⁺、hCD34⁺CD38⁻细胞比例 |
| 原代与二次移植 | FACS分选hCD45⁺CD3⁻细胞、二次支架移植、NSG-SGM3小鼠 | 验证MDS干细胞长期自我更新能力 | 二次移植后hCD45⁺植入比例及谱系分布 |
| 突变克隆验证 | 患者特异性PCR引物设计及扩增、Nextera XT建库、Illumina MiSeq测序、Variant Studio与IGV可视化 | 确认移植后细胞是否保留患者原始突变克隆结构 | 突变等位基因频率（VAF）、克隆谱系与亚克隆分布 |
关键环节
人源化支架的制备与细胞种植
该环节解决的核心问题是，如何在免疫缺陷小鼠体内构建一个可支持人源MDS造血细胞的人源基质微环境。研究使用Gelfoam可吸收明胶海绵，切割为约6.6 mm×7.5 mm×7 mm的片块，经70%乙醇和PBS洗涤复水后，以胰岛素注射器将5×10⁴～1×10⁵第2～3代人源MSC注入支架，置于超低吸附多孔板中，在37°C、5% CO₂条件下孵育48小时。随后将CD3⁻骨髓单核细胞或CD34⁺CD38⁻细胞与细胞因子补充的MyeloCult H5100共同注入已种植MSC的支架，再孵育24小时。该步骤为后续移植提供可植入的、预先装载人源基质与MDS细胞的三维载体。
支架皮下移植与小鼠模型选择
该环节解决的是如何在活体中长期维持人源微环境与MDS细胞。NSG和NSG-SGM3小鼠在移植前接受375 cGy亚致死剂量铯-137照射，通过异氟烷麻醉后，在皮肤下制作口袋并将预种植支架植入，每只小鼠最多植入三个支架。NSG-SGM3小鼠中回收的支架体积更大，人髓系细胞（CD45⁺CD33⁺）回收显著更高，因此后续研究选用NSG-SGM3小鼠。该环节产生的移植存活和支架回收数据，支撑了该模型可用于覆盖不同MDS风险组的长期植入研究。
活体高分辨率超声灌注成像
该环节解决的是如何在不处死动物的条件下判定支架是否具备功能性血管灌注。研究采用Vevo 3100系统配合MX550D探头，经尾静脉导管以300 μL/min注入50 μL Vevo MicroMarker非靶向造影剂，在非线性对比模式下记录微泡通过支架血管的过程。结果显示支架完全灌注，该数据支持支架内存在功能性血管，为MDS干细胞在支架内存活和迁移提供了血管基础，也补充了离体组织学无法直接给出的活体灌注信息。
流式细胞术定量植入效率与谱系分布
该环节解决的是如何定量人源细胞在支架内的植入比例、谱系构成及干/祖细胞表型。支架经Dispase、I型胶原酶和DNase I消化后，细胞用抗人CD45、CD33、CD19、CD3、CD34、CD38及抗鼠CD45等抗体染色，以DAPI或PI排除死细胞，在Fortessa流式细胞仪上分析。NSG-SGM3小鼠中hCD45⁺植入范围为0.2%～86%，82%病例≥20%，且高风险MDS病例呈现更明显的髓系偏向。该数据直接支持人源化支架可稳健植入MDS造血干/祖细胞并维持多谱系分化。
免疫荧光与H&E观察细胞分布和形态
该环节解决的是人源细胞在支架内空间分布及MDS病态形态的验证问题。回收支架经福尔马林固定、石蜡包埋、5 μm切片后，H&E染色显示多个低分叶核中性粒细胞，符合粒系病态造血；免疫荧光采用抗人CD45和Endomucin抗体，经热抗原修复和荧光二抗标记，用Zeiss Axio Scan Z1切片扫描仪采集图像。人CD45⁺细胞均匀分布于支架内，并邻近鼠血管结构。该数据从组织学层面支持支架维持了MDS原代细胞表型和病态形态。
靶向DNA测序验证克隆保留
该环节解决的是移植后细胞是否保留患者原始突变克隆结构的问题。研究针对患者特异性突变设计PCR引物，对从支架回收的hCD45⁺hCD33⁺细胞进行扩增，经Nextera XT建库后在Illumina MiSeq平台测序，用Variant Studio和IGV分析。结果显示SF3B1、DNMT3A、SRSF2、TET2等疾病起始突变及ASXL1、NRAS、RUNX1等进展相关突变在NSG和NSG-SGM3小鼠支架中均得以保留，VAF基本维持。该数据支持人源化微环境可维持MDS原始克隆结构。
二次移植验证自我更新能力
该环节解决的是支架中MDS干细胞是否具备长期自我更新能力。研究从原代移植小鼠支架中FACS分选hCD45⁺CD3⁻细胞，再次植入NSG-SGM3小鼠的支架中。二次移植后12周，所有小鼠均显示人源细胞植入，部分病例维持与原代相似的植入水平，部分病例植入降低。该数据从功能层面证明人源化支架可支持MDS干细胞的长期自我更新，植入降低可能与骨髓造血干细胞内在衰老及患者样本差异有关。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | MSC培养与支架种植→手术移植→流式分析与组织学 | MSC扩增和支架预种植为移植提供细胞基础，移植后通过流式和组织学评估植入结果 |
| 互补验证 | 高分辨率超声成像与免疫荧光/H&E | 超声在活体无创条件下验证支架灌注和血管化，免疫荧光和H&E在离体条件下展示人源细胞与鼠血管的空间关系 |
| 定量与定位互补 | 流式细胞术与免疫荧光 | 流式提供植入比例和谱系分布定量数据，免疫荧光提供细胞在支架内分布和病态形态的定位信息 |
| 表型与基因型互补 | 流式细胞术与靶向DNA测序 | 流式确认人源造血细胞表型，靶向测序确认移植后细胞保留患者原始突变克隆结构 |
| 干预验证 | FACS分选与二次移植 | FACS分选hCD45⁺CD3⁻细胞并进行二次移植，从功能层面验证MDS干细胞自我更新能力 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 在免疫缺陷小鼠中建立人源化微环境 | 明胶支架种植人源MSC＋皮下移植手术＋流式细胞术 | 支架提供三维基质支持，流式定量人源细胞植入效率；前提是具备人源MSC来源和免疫缺陷小鼠品系 |
| 验证支架在活体内的血管灌注 | 高分辨率超声成像＋微泡造影剂＋尾静脉导管输注 | 无创、可重复评估支架灌注状态；需注意造影剂剂量、输注速率和成像平面定位 |
| 定量人源造血细胞植入与谱系分布 | 组织消化＋多色流式抗体panel＋Fortessa流式细胞仪 | 可同时获取植入比例、髓系/淋系分布及干/祖细胞表型；前提是抗体组合与补偿设置经过验证 |
| 确认移植后突变克隆保留 | 患者特异性PCR＋Nextera XT建库＋Illumina MiSeq测序 | 在有限细胞量下验证克隆结构；需要提前获取患者原发突变谱以设计引物 |
| 验证干细胞自我更新能力 | FACS分选＋二次支架移植＋流式分析 | 功能层面证明长期自我更新；需注意二次移植细胞数量和原代植入水平对结果的影响 |
需要注意的是，上述组合基于该文献中使用的仪器和技术路径，实际研究中需根据样本来源、小鼠品系、支架材料和检测目的调整。高分辨率超声成像提供的是支架灌注的功能性证据，不直接等同于分子水平的血管生成；流式抗体组合和分选策略需结合具体研究问题设计。对于患者样本量有限的情况，该文献显示含低至10⁴ CD34⁺细胞的单核骨髓细胞即可实现植入和扩增，但具体下限仍取决于样本质量和疾病亚型。
文献信息
Mian SA, Abarrategi A, Kong KL, Rouault-Pierre K, Wood H, Oedekoven CA, Smith AE, Batsivari A, Ariza-McNaughton L, Johnson P, Snoeks T, Mufti GJ, Bonnet D. Ectopic humanized mesenchymal niche in mice enables robust engraftment of myelodysplastic stem cells. Blood Cancer Discovery, 2021, 2(2): 135-145. PMID: 33778768. DOI: 10.1158/2643-3230.BCD-20-0161.