柯萨奇病毒 A 组 19 型（CVA19）属于小 RNA 病毒科肠道病毒 C 组，此前已有报道从手足口病（HFMD）病例中首次分离到该病毒，但其导致脑脊髓炎和腹泻的致病机制因缺乏合适的动物模型而研究有限。该研究基于 7 日龄 ICR 小鼠，通过经口灌胃途径建立 CVA19 感染模型，模拟自然感染途径，并系统展示了病毒在体内的播散、组织定位、超微结构改变及炎症反应。
实验路线以 qPCR 动态监测多器官病毒载量为起点，结合 IF 和 FISH 对病毒 RNA 与神经元、星形胶质细胞及脊髓运动神经元标志物进行共定位，辅以 HE、Nissl、PAS 和 AB 染色评估组织病理变化，再通过透射电镜观察脊髓神经元超微结构及病毒颗粒形态，利用 WB 检测凋亡和星形胶质细胞活化相关蛋白表达，最终以脊髓裂解液回接乳鼠验证 Koch 法则。核心仪器或技术承担了从病毒定量、定位、形态学验证到蛋白水平确认的不同层次证据，共同支撑 CVA19 的嗜神经性和肠道损伤结论。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 病毒株制备与滴度测定 | 3 日龄小鼠腹腔接种、组织匀浆、0.22 μm 过滤、qPCR 绝对定量 | 获得自然适应小鼠的 CVA19 病毒原液并确定接种滴度 | 病毒 RNA 拷贝数（1.47 × 10¹⁰ copies/μL） |
| 感染模型建立与剂量-年龄优化 | 经口灌胃（自制止胃针）、临床评分、生存曲线 | 确定适宜接种剂量和小鼠日龄 | 体重变化、临床评分、生存率 |
| 病毒载量动态检测 | TRIzol 提取 RNA、逆转录、qPCR、标准曲线绝对定量 | 明确 CVA19 在体内的播散动力学和组织嗜性 | 各组织器官 Log10 病毒 RNA 拷贝数/mg 或 mL |
| 脑组织病毒定位与病理 | HE 染色、Nissl 染色、IF、FISH、WB、琼脂糖凝胶电泳 | 确认 CVA19 直接感染脑神经元和星形胶质细胞 | 病理图像、病毒 RNA 荧光信号、cleaved-Caspase3 和 GFAP 蛋白表达 |
| 脊髓运动神经元感染与损伤评估 | HE 染色、Nissl 染色、IF、FISH、WB | 确认 CVA19 感染脊髓运动神经元并导致急性弛缓性麻痹 | 运动神经元标志物（ChAT、NeuN）共定位、病毒 RNA 信号、凋亡和胶质活化蛋白表达 |
| 脊髓超微结构观察 | 透射电子显微镜（TEM）、锇酸后固定、树脂包埋、超薄切片 | 观察病毒颗粒形态及神经元细胞器损伤 | 亚细胞结构图像、约 25～40 nm 病毒颗粒、线粒体和内质网改变 |
| Koch 法则验证 | 脊髓裂解液制备、腹腔接种 3 日龄乳鼠、临床监测 | 验证 CVA19 是致麻痹的直接原因 | 体重、临床评分、生存率 |
| 肠道损伤与腹泻评估 | 腹泻评分、MPO 活性检测、HE、PAS、AB 染色、IF | 明确 CVA19 感染导致小肠炎症性损伤和腹泻 | 腹泻评分、MPO 活性、组织病理评分、分泌细胞计数、免疫细胞浸润数据 |
| 全身炎症反应检测 | 自动动物血细胞分析仪、ELISA | 评估 CVA19 感染诱导的系统性炎症 | 白细胞、粒细胞、单核细胞计数、血清 IL-6、TNF-α、CXCL-1、MCP-1 浓度 |
| 保护性评估 | 腹腔注射抗血清、IFN-α2、IFN-β、利巴韦林、VP1 单抗、临床监测 | 评价被动免疫和抗病毒治疗对 CVA19 感染的保护效果 | 临床评分、生存率 |
关键环节
病毒感染模型的剂量与年龄优化
建立肠道病毒动物模型需要解决病毒株、小鼠品系、感染途径、接种剂量和日龄等关键变量。该研究选用从 HFMD 患儿粪便中分离的 CVA19 株，该毒株在 RD 细胞和 Vero 细胞中无法增殖，但自然适应小鼠。通过 3 日龄小鼠腹腔接种制备病毒原液，组织匀浆经 12000 × g 离心和 0.22 μm 过滤后获得滴度为 1.47 × 10¹⁰ viral RNA copies/μL 的病毒液。
为确定适宜接种剂量，7 日龄 ICR 小鼠经口灌胃接种 10⁴、10⁶、10⁸、10¹⁰ copies/mouse，结果显示 10⁸ 和 10¹⁰ 剂量组临床症状出现更早、死亡率更高，10⁸ copies/mouse 被选为后续实验剂量。在年龄优化实验中，5、7、10 日龄小鼠分别接种 10⁸ copies/mouse，5 日龄和 7 日龄小鼠均出现体重下降和高临床评分，分别于 10 dpi 和 12 dpi 全部死亡；10 日龄小鼠症状较轻并最终恢复，生存率为 87.5%。综合操作性和重复性，7 日龄 ICR 小鼠被确定为建模条件。
该环节产生的体重、临床评分和生存率数据，构成了后续病理和病毒学检测的模型基础，说明 CVA19 对新生小鼠的致病性呈剂量和年龄依赖性。
qPCR 动态监测病毒载量与组织嗜性
明确病毒在体内的播散动力学需要定量检测多个组织器官中的病毒 RNA。该研究在感染后 3、5、8 dpi 采集脑、肺、心、肝、脾、肠、肾、肌肉、血液和脊髓，使用 TRIzol 提取总 RNA，血液样本使用 RNAiso Blood kit 提取，经逆转录获得 cDNA 后以 CVA19 VP1 特异性引物进行 qPCR，目标产物 118 bp 插入 pET-28a (+) 质粒作为标准品，通过 10²～10¹¹ copies/μL 系列稀释建立标准曲线进行绝对定量，病毒载量以 Log10（viral RNA copies/mg 组织或 mL 血液）表示。
数据显示，感染早期（3 dpi）血液、肠道、心脏和脾脏中即可检测到病毒复制，血液中较高的病毒载量提示早期病毒血症。3～5 dpi 期间多种组织器官病毒载量快速上升，其中肌肉、脾脏、肝脏和肺脏上升更为明显。血液、脾脏、肝脏和肺脏在 5 dpi 达到峰值后逐渐下降，而骨骼肌病毒载量持续升高，8 dpi 时达到约 10⁹ copies/mg，比其他组织高 3～5 个数量级，提示肌肉嗜性。脊髓和脑组织中病毒载量相对较低，但各时间点均可检测到，表明 CVA19 成功进入中枢神经系统。
qPCR 数据将病毒复制的时间进程与小鼠临床表现联系起来，为后续定位和病理研究提供了组织选择依据。
IF 和 FISH 定位病毒 RNA 与细胞类型
病毒载量数据不能回答 CVA19 具体感染哪些细胞类型。该研究采用免疫荧光和荧光原位杂交进行病毒 RNA 与细胞标志物的共定位。IF 实验中，石蜡切片经脱蜡、抗原修复和 BSA 封闭后，与一抗 4 ℃ 孵育过夜，再与二抗室温避光孵育 50 min，DAPI 复染细胞核，使用荧光显微镜（OLYMPUS IX73）采集图像。FISH 使用地高辛标记的 CVA19 特异性 DNA 探针（5‘-CCAATTATAGCCACACAAGCGGATCTCCCAAA-3’），经蛋白酶 K 处理、预杂交、探针杂交过夜、抗 DIG-HRP 和 TSA 显色后 DAPI 复染，显微镜检并拍照。
在脑组织中，IF 和 FISH 结果显示病毒 RNA 弥漫分布于感染小鼠脑内神经元（主要位于大脑皮层、海马和丘脑），并与神经元标志物 NeuN 共定位；同时检测到 CVA19 与 GFAP 双阳性细胞（主要位于海马），表明 CVA19 也可直接感染星形胶质细胞。在脊髓中，Anterior horn motor neurons 通过 ChAT 和 NeuN 共定位标记，严重感染小鼠（四肢瘫痪）脊髓前角 ChAT 和 NeuN 染色明显减少，对应受累肢体的运动神经元数量下降，同时左右角运动神经元中均可检测到强病毒 RNA 信号。
IF 和 FISH 数据从细胞类型层面确认了 CVA19 对脑神经元、星形胶质细胞和脊髓运动神经元的直接感染，补充了 qPCR 仅能提供组织水平病毒载量的不足。
组织病理染色评估神经系统和肠道损伤
病毒感染的细胞定位需要与组织病理损伤对应。该研究在 10 dpi 对严重或危重小鼠实施安乐死，组织经 4% 多聚甲醛固定、石蜡包埋后，分别进行 HE、Nissl、PAS 和 AB 染色。脑组织 HE 染色显示血管周围炎症细胞袖套形成、实质炎症细胞浸润、微胶质结节和局灶性噬神经元现象，Nissl 染色显示部分神经元排列紊乱、Nissl 体数量减少。脊髓 HE 和 Nissl 染色显示 Nissl 体丢失、神经元排列紊乱和变性，部分神经元出现核空泡化。肠道组织 HE 染色显示小肠绒毛缩短、炎症细胞浸润和组织结构破坏，PAS 和 AB 染色显示分泌酸黏蛋白的杯状细胞和分泌中性黏蛋白的细胞数量增加。肠道病理评分采用改良评分系统，由两位对处理条件不知情的病理学家从绒毛萎缩、上皮损伤、急性炎症、慢性炎症和炎症深度五个因素进行 0～3 分评估，总分 0～15 分。
组织病理数据将病毒感染的细胞定位与器官水平的结构损伤联系起来，支持 CVA19 感染导致脑脊髓炎和肠道炎症性损伤的结论。
透射电镜观察脊髓神经元超微结构和病毒颗粒
组织病理和病毒定位数据无法展示病毒颗粒形态和亚细胞结构改变。该研究采集感染小鼠脊髓，经电镜固定液固定、PBS 洗涤、1% 锇酸后固定、梯度乙醇脱水、Araldite 812 包埋后制备 90 nm 超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色，使用 Hitachi HT7800 电子显微镜在 120 kV 电压下观察。
未感染小鼠脊髓神经元直径 25～60 μm，电子密度和形态正常，Nissl 体、内质网、线粒体和轴突结构完整。感染小鼠神经元胞质内各种大小的空泡显著增多，可见核固缩和核膜凹陷，退化神经元周围有含吞噬物质的胶质细胞，提示高吞噬活性。Nissl 物质消失或减少，内质网池肿胀稀疏，游离核糖体增多，线粒体嵴扩张、排列不规则、基质密度降低，同时可见较致密的萎缩线粒体。高倍电镜显示感染神经元中存在大小一致、亚结构一致的 CVA19 颗粒，直径 25～40 nm，部分子代病毒体被单独包裹在小囊泡中。
TEM 数据从超微结构层面确认了 CVA19 在脊髓神经元内的病毒颗粒存在和细胞器损伤，与 qPCR 和 FISH 的病毒 RNA 检测结果形成互补验证。
WB 检测凋亡和星形胶质细胞活化相关蛋白
病毒 RNA 定位和病理形态不能直接量化凋亡和胶质活化的蛋白水平。该研究在 5 dpi 和 8 dpi 分别取轻度症状（临床评分 3 分）和重度症状（临床评分 4 分及以上）小鼠各 3 只，取脑和脊髓在含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 缓冲液中匀浆提取总蛋白，经 10% SDS-PAGE 分离后转至 PVDF 膜，5% 脱脂奶粉封闭，一抗（1:1000 稀释）4 ℃ 孵育过夜，二抗（1:3000 稀释）孵育后使用增强化学发光试剂盒显色，Image J 软件计算蛋白条带积分强度。
脑组织中，cleaved-Caspase3 在轻度和重度感染组均增加约 1.5 倍，GFAP 从轻度感染组的 2.5 倍增至重度感染组的 3.5 倍。脊髓中，轻度感染组 cleaved-Caspase3 和 GFAP 均较对照组升高，但仅 GFAP 变化有统计学显著性；重度感染组两种蛋白均显著升高。此外，VP1 琼脂糖凝胶电泳显示 917 bp 条带，验证了病毒 RNA 的存在。
WB 数据从蛋白水平量化了 CVA19 感染诱导的神经元凋亡和星形胶质细胞活化，与 IF 和 FISH 的细胞定位结果相互印证。
Koch 法则验证
为验证 CVA19 是否是致麻痹的直接原因，该研究取轻度症状（临床评分 3 分）和重度症状（临床评分 4 分及以上）小鼠的脊髓，在 PBS 中匀浆（10% wt/vol），经 0.22 μm 过滤后分别腹腔接种 3 日龄 ICR 小鼠。结果显示，接种感染小鼠脊髓裂解液的乳鼠几乎无体重增加，出现活动减少、肢体无力和麻痹，临床评分逐渐升高，分别在 5 dpi（轻度上清）和 6 dpi（重度上清）内全部死亡，对照组无明显异常。
该实验表明感染小鼠脊髓裂解液中的病毒可再次引起乳鼠麻痹，在一定程度上满足 Koch 法则，支持 CVA19 是致麻痹的直接原因。
肠道损伤、腹泻与全身炎症反应评估
CVA19 感染在临床上可导致腹泻，该研究通过腹泻评分、MPO 活性、组织病理和免疫细胞浸润评估肠道损伤。感染小鼠 6 dpi 出现黄色软便或不成形粪便，肛周皮毛染色，小肠尤其是空肠出现严重胀气、肠系膜毛细血管充血和大量黄色泡沫状液体，平均腹泻评分达 1.71，肠道 MPO 活性显著升高。小肠组织病理显示绒毛缩短、炎症细胞浸润和组织结构完全破坏，病理评分升高。IF 结果显示 CVA19 病毒 RNA 与 cleaved-Caspase3 在小肠绒毛细胞中共定位，感染小鼠 cleaved-Caspase3 表达升高，提示病毒感染导致小肠细胞凋亡。CD45⁺ 白细胞、CD11b⁺ 单核细胞和 Ly6G⁺ 中性粒细胞在感染小鼠小肠组织中的数量显著增加。
血液学检测显示，感染小鼠 5 dpi 时白细胞、粒细胞和单核细胞数量显著升高，粒细胞和单核细胞在 3 dpi 即显著增加。ELISA 检测显示血清 IL-6 和 TNF-α 分别在 5 dpi 和 8 dpi 显著升高，CXCL-1 和 MCP-1 浓度也显著升高。这些数据表明 CVA19 感染诱导了系统性炎症反应。
保护性评估
为评价抗病毒药物和被动免疫的保护效果，该研究在感染后 1 h 内腹腔注射利巴韦林、CVA19 VP1 单抗、不同稀释度的 CVA19 抗血清或阴性血清，以及肌肉注射 IFN-α2 或 IFN-β，每日监测临床评分和死亡率至 15 dpi。结果显示，利巴韦林和 CVA19 VP1 单抗未能阻止疾病进展，小鼠仍在 7～12 dpi 内死亡。CVA19 抗血清可显著提高生存率并减轻临床症状，不同稀释度的平均临床评分随抗血清浓度增加而降低，生存率呈剂量-反应效应。IFN-β 治疗组未见恢复迹象，而 IFN-α2 治疗组部分小鼠症状较轻，从 7 dpi 逐渐恢复，最终生存率为 50%。
该环节的数据表明，含有中和抗体的 CVA19 抗血清和 IFN-α2 可提供保护效果，而利巴韦林和 VP1 单抗在本模型中的保护作用有限。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 定量与定位互补 | qPCR、IF、FISH | qPCR 提供组织水平的病毒载量动态，IF 和 FISH 提供细胞水平的病毒 RNA 定位和细胞类型鉴定，两者结合确定病毒嗜性 |
| 形态与分子验证 | HE/Nissl/PAS/AB 染色、TEM、WB | 组织病理显示器官和细胞水平的结构损伤，TEM 展示亚细胞结构和病毒颗粒形态，WB 量化凋亡和胶质活化相关蛋白表达，形成从形态到分子的验证链 |
| 病毒分离与致病性验证 | qPCR、脊髓裂解液回接实验 | qPCR 确认脊髓中存在病毒 RNA，裂解液回接乳鼠验证其致病性，部分满足 Koch 法则 |
| 免疫状态与保护评估 | 血细胞分析仪、ELISA、抗血清/IFN 治疗实验 | 血液学和细胞因子数据反映系统性炎症状态，保护实验验证抗血清和 IFN-α2 的干预效果 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 建立经口感染病毒动物模型并确定接种条件 | 经口灌胃装置、临床评分系统、生存分析 | 模拟自然感染途径，通过剂量和年龄梯度确定建模条件，适用于肠道病毒或其他经口传播病原体 |
| 动态监测病毒在体内的播散和组织嗜性 | qPCR 绝对定量、多组织采样、标准曲线制备 | 提供各组织器官病毒载量的时间序列数据，识别主要复制位点和靶器官 |
| 确认病毒感染的细胞类型 | IF、FISH、荧光显微镜、细胞类型特异性标志物 | 在细胞水平定位病毒 RNA，区分神经元、星形胶质细胞等靶细胞，前提是具备特异性探针和可靠抗体 |
| 评估组织病理损伤和超微结构改变 | HE/Nissl/PAS/AB 染色、透射电镜、超薄切片 | 从组织到亚细胞水平展示病理损伤，TEM 可观察到病毒颗粒形态，适用于神经系统和肠道损伤研究 |
| 量化感染相关蛋白表达变化 | WB、凝胶成像系统、Image J 定量 | 提供凋亡和胶质活化相关蛋白的定量数据，与 IF 和病理结果相互印证 |
| 验证病原体与疾病的因果关系 | 组织裂解液制备、回接实验、临床监测 | 通过回接实验部分满足 Koch 法则，适用于难以体外培养的病毒 |
| 评价抗病毒药物和被动免疫保护效果 | 抗血清制备、IFN 治疗、临床评分和生存分析 | 在同一模型上比较不同干预措施的保护效果，为疫苗和抗病毒药物评价提供工具 |
在类似研究中，经口感染模型更接近自然感染途径，但需要根据病毒株的宿主适应性和小鼠日龄进行优化。qPCR 绝对定量需要制备标准品和标准曲线，IF 和 FISH 需要验证探针和抗体的特异性，TEM 样本制备需要保证超微结构完整性。WB 结果需要结合内参和统计学分析。如果研究目标是评价疫苗或抗病毒药物，该模型可提供从病毒载量、病理损伤到生存率的综合评价体系。需要注意的是，该模型中 CVA19 对骨骼肌的强嗜性在人类感染中未见报道，且感染小鼠未出现 HFMD 典型的皮疹和口腔溃疡，因此在转化应用时需要结合其他指标综合判断。
文献信息
Ji W, Tao L, Li D, et al. A mouse model and pathogenesis study for CVA19 first isolated from hand, foot, and mouth disease. Emerging Microbes & Infections, 2023. PMID: 36735880. DOI: 10.1080/22221751.2023.2177084.