携带 inv(3)(q21q26.2)/t(3;3)(q21;q26.2) 与单体 7 的 MDS/AML 属于侵袭性强的髓系肿瘤，其分子发病机制与治疗策略长期缺乏可重复的体外与体内模型。本研究从一例由 MDS-EB2 转化为 AML-MRC 的患者骨髓样本出发，在白血病转化时采集骨髓单个核细胞（BMMNC），经尾静脉注射入亚致死剂量照射的 NSG 小鼠建立原代 PDX，再以连续移植验证可传代性，同时用 OP9 基质细胞共培养体系建立 YCU-AML1 细胞系。流式细胞术、G 显带核型分析、定量 RT-PCR 与靶向深度测序分别承担免疫表型、细胞遗传学、EVI1/GATA2 表达及突变谱的验证，形成从临床表型到分子基础的证据链。
该模型的核心价值不在于复述某一结论，而在于展示每类仪器或技术在建模流程中承担的具体任务：哪些环节用于确认移植成功，哪些用于确认细胞系身份，哪些用于确认分子特征与原发疾病一致。对实验人员而言，理解这一分工有助于在类似高危髓系肿瘤建模中合理配置仪器与技术组合。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 患者骨髓样本采集与临床诊断 | 骨髓穿刺、H&E 染色、Wright-Giemsa 染色、POX 染色、铁染色 | 确认疾病阶段与形态学特征，明确白血病转化时点 | 骨髓细胞形态、病态造血特征、原始细胞比例 |
| 原代 PDX 建立 | 尾静脉注射、亚致死剂量照射 NSG 小鼠 | 将患者 BMMNC 植入免疫缺陷小鼠，实现体内扩增 | 移植小鼠存活、外周血原始细胞出现 |
| PDX 表型验证 | 全血细胞计数（Celltacα）、流式细胞术（BD FACS Canto II / FACSCelesta） | 确认白血病表型（贫血、血小板减少、原始细胞免疫表型） | 血细胞计数、CD34/CD38/CD13/CD33 表达比例 |
| PDX 组织学验证 | H&E 染色、免疫组化（Leica BOND-MAX 自动染色仪） | 确认骨髓与脾脏中原始细胞浸润 | 组织病理图像、CD34/CD38 阳性浸润 |
| 连续移植与 LSC 频率测定 | 尾静脉注射、有限稀释法、L-Calc 软件回归分析 | 验证模型可重复性并量化白血病干细胞频率 | 二次移植小鼠存活、LSC 频率估计值 |
| 细胞系建立与体外培养 | OP9 基质细胞共培养、GM-CSF 补充、Vi-Cell XR 细胞计数仪 | 在体外维持患者来源白血病细胞增殖 | 生长曲线、细胞形态、免疫表型 |
| 细胞遗传学验证 | G 显带核型分析、KaryoMAX Colcemid 细胞周期阻滞 | 确认 t(3;3)(q21;q26.2) 与单体 7 的保留 | 核型图谱、染色体数目与结构异常 |
| 基因表达验证 | 定量 RT-PCR（StepOnePlus Real-Time PCR System） | 检测 EVI1 高表达与 GATA2 低表达 | 相对表达量（ΔCt 法） |
| 突变谱验证 | 靶向深度测序（Oncomine Myeloid Research panel、Ion PGM 测序仪、Ion Reporter 分析） | 确认突变谱与 inv(3)/t(3;3) 髓系肿瘤一致 | KIT、SF3B1、TET2、BCOR 突变及 VAF |
关键环节
患者样本采集与临床背景确认
建模的起点是明确样本对应的疾病阶段。患者初诊为 MDS-EB2，初诊骨髓核型正常，第二次骨髓检查在白血病转化时发现 t(3;3)(q21;q26.2) 与单体 7，20 个中期细胞中 19 个存在该异常。骨髓涂片显示病态造血累及三系，包括粒系颗粒减少、巨核细胞核低分叶与多核、环形铁粒幼细胞，原始细胞比例 28.5%。流式细胞术确认 HLA-DR、CD13、CD33、CD34、CD38 高阳性，并伴有 CD7 异常表达。这些形态学与免疫表型数据共同定义了后续模型需要复现的表型基准。
原代 PDX 建立与移植验证
体内建模解决的是患者来源白血病细胞在体外难以长期维持的问题。研究将 1.0 × 10⁶ 患者 BMMNC 经尾静脉注射入亚致死剂量（2.4 Gy）照射的 NSG 小鼠，所有注射小鼠在 2 个月内发生致死性白血病。移植后 8 周，外周血涂片显示 POX 阳性与阴性原始细胞伴空泡，与原发患者形态相似。全血细胞计数显示白细胞减少（均值 4800/μL，对照 20,400/μL，p = 0.0004）、贫血（Hb 均值 7.7 g/dL，对照 15.97 g/dL，p < 0.0001）与血小板减少（均值 5.43 × 10⁴/μL，对照 81.3 × 10⁴/μL，p = 0.0004）。脾脏重量显著增加（均值 671 mg，对照 98.67 mg，p < 0.0001），骨髓与脾脏病理显示原始细胞浸润并破坏正常脾脏结构，免疫组化确认 CD34⁺/CD38⁺ 原始细胞浸润。该环节说明尾静脉注射联合免疫缺陷小鼠可有效建立可评估的体内模型。
免疫表型分析与亚群区分
流式细胞术承担的是确认移植细胞身份与区分微环境亚群的任务。原代 PDX 小鼠外周血、骨髓与脾脏的原始细胞以 CD45 设门，显示 CD34⁺/CD38⁻ 与 CD13⁺/CD33⁺ 比例升高。骨髓中观察到两个亚群（CD34⁺/CD38⁺ 与 CD34⁻/CD38⁺），而脾脏以 CD34⁺/CD38⁺ 为主要群体，两处均以 CD13⁺/CD33⁺ 为主。原发患者骨髓细胞注射前也呈现类似的 CD34、CD38、CD13、CD33 高阳性。该数据支持 PDX 模型在免疫表型上模拟原发疾病的判断，同时提示骨髓与脾脏作为白血病微环境可能存在功能差异。
连续移植与白血病干细胞频率测定
连续移植解决的是模型可重复性问题。将原代 PDX 小鼠冷冻保存的骨髓细胞经尾静脉注射入亚致死剂量照射的 NSG 小鼠，二次移植小鼠同样出现贫血、血小板减少、器官肿大与骨髓细胞数下降，骨髓与脾脏可见大量原始细胞浸润，流式细胞术确认两个亚群与 CD13⁺/CD33⁺ 原始细胞扩增，所有二次受体在 2 个月内死于白血病进展。有限稀释法结合 L-Calc 软件回归分析估算白血病干细胞频率为 16,263 分之一。该环节为模型的可传代性与干细胞层级提供了定量证据。
体外共培养与细胞系建立
体外建模解决的是获得可长期培养、便于干预实验的细胞系。原代 PDX 小鼠的冷冻保存骨髓细胞在 OP9 基质细胞共培养体系、含 20 ng/mL GM-CSF 的 Iscove 培养基中持续增殖超过 3 个月，建立 YCU-AML1 细胞系。培养细胞维持与原发患者一致的高 CD34、CD38、CD13、CD33 阳性。在 GM-CSF（10 ng/mL）刺激下，YCU-AML1 细胞的集落数高于健康对照 BMMNC，提示 GM-CSF 高敏感性是该类白血病细胞的特征之一。
细胞遗传学、基因表达与突变谱验证
分子验证环节解决的是模型是否保留原发疾病遗传学与分子特征的问题。G 显带核型分析显示原代 PDX 小鼠骨髓细胞 20 个中期全部携带 t(3;3)(q21;q26.2) 与单体 7。定量 RT-PCR 显示 CD34⁺ YCU-AML1 细胞中 EVI1 表达高于健康对照 CD34⁺ 细胞，GATA2 表达低于对照，符合 inv(3)/t(3;3) 重排导致 EVI1 激活与 GATA2 单倍剂量不足的机制。靶向深度测序在 PDX 小鼠 BMMNC 中检出 KIT D816V（VAF 51.33%）、SF3B1 K700E（VAF 52%）、TET2 F868L（VAF 48.15%）杂合突变及 X 连锁 BCOR W1218Ter 半合子突变（VAF 100%）。该突变谱与已发表的 inv(3)/t(3;3) 髓系肿瘤突变谱在信号通路、剪接机制与表观遗传三类基因上一致，支持模型在分子基础上模拟原发疾病。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | 尾静脉注射 + 流式细胞术 + 全血细胞计数 | 移植后以外周血与骨髓表型确认植入成功，并为后续连续移植提供细胞来源 |
| 互补验证 | G 显带核型分析 + 定量 RT-PCR + 靶向深度测序 | 分别在染色体、转录与基因突变层面确认模型分子特征，三者相互补充 |
| 体外与体内对应 | OP9 共培养 + PDX 连续移植 | 体外细胞系与体内 PDX 模型共享同一患者来源，可在不同实验场景中互为参照 |
| 表型与分子关联 | 流式细胞术 + 靶向深度测序 | 免疫表型异常与突变谱结合，支持模型与原发疾病在临床与分子层面的对应关系 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 建立高危髓系肿瘤体内模型 | 亚致死剂量照射 NSG 小鼠 + 尾静脉注射 + 全血细胞计数 + 流式细胞术 | 以免疫缺陷小鼠为宿主，经尾静脉途径植入患者骨髓单个核细胞，用血细胞计数与流式细胞术确认植入与白血病表型 |
| 验证模型可传代性 | 连续尾静脉移植 + 有限稀释法 + L-Calc 回归分析 | 通过二次移植与梯度细胞数接种评估模型可重复性并估算白血病干细胞频率 |
| 建立体外长期培养体系 | OP9 基质细胞共培养 + GM-CSF 补充 + Vi-Cell XR 细胞计数 | 在基质细胞支持与细胞因子补充条件下维持患者来源白血病细胞增殖，并监测生长曲线 |
| 确认模型分子特征 | G 显带核型分析 + 定量 RT-PCR + 靶向深度测序 | 从染色体结构、基因表达与突变谱三个层面确认模型与原发疾病一致 |
上述组合的适用前提是能够获得白血病转化时点的患者骨髓样本，并具备免疫缺陷小鼠操作与照射条件。需要注意的是，PDX 模型的植入效率与传代稳定性可能受样本状态、注射细胞数与宿主品系影响；靶向深度测序的突变检出需结合 VAF 与覆盖度解读。更稳妥的理解是，该组合提供的是从表型到分子的多层次验证框架，具体仪器配置需根据样本基质与研究目标调整。
文献信息
Kunimoto H, Fukuchi Y, Murakami K, et al. Establishment of a High-risk MDS/AML Cell Line YCU-AML1 and its Xenograft Model Harboring t(3;3) and Monosomy 7. HemaSphere. 2020;4(5):e469. doi:10.1097/HS9.0000000000000469. PMID: 33163905.