小鼠腔前卵泡体外培养的难点在于成熟率不稳定，而成熟率受物种、卵泡发育阶段与 FSH 浓度影响。该研究以 14 日龄雌性 ICR 小鼠为来源，机械分离直径 80～100 μm 的初级卵泡（PM 卵泡）与 110～130 μm 的早期次级卵泡（ES 卵泡），分别在含 10 mIU/mL 或 100 mIU/mL r-FSH 的 α-MEM 二维液滴体系中培养 10 天，观察卵泡生长、贴壁、腔形成与卵母细胞成熟，以评估不同发育阶段卵泡对 FSH 的敏感性差异。
研究中，体视显微镜与 Image Pro-Plus 6.0 承担形态学观察和贴壁面积测量，荧光显微镜与 Western blot 成像系统分别完成 FSHR 定位及 FSHR、Ki-67、3β-HSD、CYP17、CYP19 表达检测，酶标仪完成 E2 的 ELISA 定量。形态学、蛋白表达与激素分泌数据共同构成从「卵泡分级—FSH 浓度选择—颗粒细胞增殖与激素合成—卵母细胞成熟」的证据链，用于判断哪一发育阶段和哪一 FSH 浓度更适合构建体外培养模型。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 卵泡分离与分级 | 体视显微镜、26G 针机械分离 | 从 14 日龄小鼠卵巢获得单一发育阶段的腔前卵泡 | 卵泡直径、颗粒细胞层数、各级卵泡数量 |
| 二维液滴培养与 r-FSH 干预 | 60 mm 培养皿、矿物油覆盖的 20 µL α-MEM 液滴、37 ℃ 5% CO₂ 培养 | 在相同基质条件下比较 PM 与 ES 卵泡对 10 与 100 mIU/mL r-FSH 的响应 | 贴壁率、腔形成率、发育停滞率、退化率 |
| 形态学连续观察 | 体视显微镜、Image Pro-Plus 6.0 | 记录贴壁、颗粒细胞穿出基底膜、卵泡腔出现及空间生长模式 | D2、D4、D6、D8、D10 形态图像与贴壁面积 |
| 排卵诱导与成熟评估 | hCG 处理、体视显微镜下剥除颗粒细胞 | 判断卵泡是否具备排出 COCs 与成熟卵母细胞的能力 | COCs 排出率、MII 卵母细胞比例 |
| FSHR 定位与定量 | 石蜡切片、免疫荧光、荧光显微镜、Image Pro-Plus 6.0、Western blot | 确认 FSHR 在颗粒细胞的表达并比较 PM 与 ES 卵泡水平 | FSHR 荧光强度、Western blot 灰度值 |
| 颗粒细胞增殖与激素合成检测 | Western blot、ELISA、酶标仪 | 评估 FSH 对颗粒细胞增殖与类固醇合成酶表达、E2 分泌的影响 | Ki-67、3β-HSD、CYP17、CYP19 表达量；E2 浓度 |
关键环节
卵泡分离与分级
腔前卵泡体外培养稳定性的一个来源是起始卵泡群体不纯，80～180 μm 范围内实际包含 PM 与 ES 两个发育阶段。研究在去除卵巢周围组织后，用 26G 针机械刮取卵巢释放卵泡，并在 L-15 培养基中洗涤，依据 Pedersen 和 Peters 分级标准挑选 PM 卵泡（约 80～100 μm，含 1～2 层立方颗粒细胞）与 ES 卵泡（约 110～130 μm，含 3 层立方颗粒细胞）。体视显微镜下完成分级后，两类卵泡分别进入培养，从而把发育阶段作为独立变量，而不是把不同级别卵泡混合培养。
二维液滴培养与 r-FSH 干预
培养体系为 60 mm 培养皿内 15 个 20 µL α-MEM 液滴，补充 5% FBS、1% ITS 及 10 或 100 mIU/mL r-FSH，上覆 5 mL 矿物油，37 ℃、5% CO₂ 培养 10 天。单卵泡单液滴的布局使每个卵泡的发育结局可独立追踪，矿物油覆盖减少液滴蒸发与污染风险。D2、D4、D6、D8、D10 更换并收集培养基，同时记录形态。该环节产生的贴壁率、腔形成率与退化率数据，直接对应不同发育阶段与 FSH 浓度下卵泡能否进入腔前卵泡向窦卵泡转化的关键节点。
形态学观察与空间生长模式判定
体视显微镜下的连续观察用于区分正常卵泡、闭锁卵泡与退化卵泡。多数卵泡在 D2 贴壁，贴壁被视为存活；D4 颗粒细胞增殖并穿出基底膜，ES 卵泡更明显；D6 ES 卵泡颗粒细胞继续增殖并向外隆起；D8 多数 ES 卵泡开始形成卵泡腔，而 PM 卵泡仅少数在 100 mIU/mL r-FSH 下成腔；D10 卵泡腔继续增大，接近成熟。Image Pro-Plus 6.0 测量贴壁面积后发现，10 mIU/mL r-FSH 下 ES 卵泡呈平铺生长、贴壁面积大，100 mIU/mL 下呈三维空间生长、贴壁面积小，后者更接近体内排卵前卵泡的形态。该形态学证据把 FSH 的作用从「提高发育率」扩展到「改变体外生长模式」。
排卵诱导与卵母细胞成熟评估
培养结束后，卵泡在含 2.5 IU/mL hCG 的 α-MEM 中继续培养 16 小时以诱导排卵，随后从卵泡中排出 COCs，在体视显微镜下剥除卵母细胞周围颗粒细胞。具有第一极体且胞质均匀的卵母细胞记为正常成熟卵母细胞，即 MII 期卵母细胞。这一环节把卵泡形态学终点推进到功能终点：PM 卵泡在 10 mIU/mL r-FSH 下未形成卵泡腔，无成熟卵母细胞；ES 卵泡在 100 mIU/mL r-FSH 下成熟率 80.88%，显著高于 10 mIU/mL 下的 48.55%。成熟率数据是判断该体系能否作为卵母细胞来源模型的核心指标。
FSHR 表达与 FSH 敏感性来源
为解释 PM 与 ES 卵泡对 FSH 响应不同的原因，研究用免疫荧光在 D14 小鼠卵巢组织切片中定位 FSHR，并以 Western blot 比较分离卵泡中的表达水平。免疫荧光显示 FSHR 表达于颗粒细胞，而非卵母细胞或卵泡膜细胞；ES 卵泡 FSHR 平均荧光强度与蛋白水平均显著高于 PM 卵泡。该结果说明 ES 卵泡对 FSH 更敏感，为「高 FSH 浓度更适合 ES 卵泡」提供受体层面的依据。
颗粒细胞增殖与类固醇合成功能
Ki-67 作为细胞增殖标志物，通过 Western blot 检测。ES 卵泡颗粒细胞 Ki-67 水平显著高于 PM 卵泡；100 mIU/mL r-FSH 下两类卵泡 Ki-67 均高于 10 mIU/mL。类固醇合成限速酶 3β-HSD、CYP17、CYP19 的表达在 ES 卵泡中高于 PM 卵泡，且 100 mIU/mL r-FSH 下 ES 卵泡显著高于 10 mIU/mL。ELISA 检测培养上清 E2 浓度，D4、D6、D8、D10 各时间点 ES 卵泡均高于 PM 卵泡，ES 卵泡在 100 mIU/mL 下 E2 水平显著高于 10 mIU/mL，而 PM 卵泡在两种 FSH 浓度间差异不显著。增殖与激素合成数据把形态学上的生长模式差异与颗粒细胞功能状态联系起来。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | 体视显微镜、二维液滴培养、hCG 诱导排卵 | 体视显微镜完成卵泡分级后进入培养，培养终点再以 hCG 诱导排卵并在体视显微镜下评估成熟，形成从分离到成熟的连续流程 |
| 形态与定量互补 | 体视显微镜、Image Pro-Plus 6.0、ELISA | 形态观察提供贴壁、成腔与空间生长模式，Image Pro-Plus 定量贴壁面积，ELISA 提供 E2 分泌数据，共同描述卵泡发育状态 |
| 定位与定量验证 | 免疫荧光、Western blot | 免疫荧光确认 FSHR 在颗粒细胞的表达定位，Western blot 比较 PM 与 ES 卵泡间表达量差异，两者互为补充 |
| 干预与响应 | r-FSH 浓度设置、FSHR 检测、Ki-67 与类固醇合成酶检测 | 不同 r-FSH 浓度作为干预变量，FSHR 表达解释敏感性差异，Ki-67 与合成酶反映下游响应，形成干预—受体—效应链条 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 建立稳定的腔前卵泡体外培养模型 | 体视显微镜＋机械分离＋二维液滴培养＋hCG 诱导排卵 | 按直径和颗粒细胞层数分级后分别培养，可减少混合发育阶段带来的成熟率波动；适用于小鼠腔前卵泡研究，前提是具备稳定的分级标准和单卵泡培养条件 |
| 评估不同发育阶段卵泡对激素的敏感性 | 免疫荧光＋Western blot＋ELISA | FSHR 定位与定量、增殖标志物和激素分泌检测可共同解释卵泡响应差异；适用于需要区分受体表达与功能效应关系的研究 |
| 观察卵泡体外空间生长模式 | 体视显微镜连续观察＋Image Pro-Plus 面积定量 | 可区分平铺生长与三维空间生长，并判断哪种模式更接近体内状态；前提是培养容器与观察时间点一致，且图像采集参数稳定 |
需要注意的是，该研究使用的是 ICR 小鼠来源的 PM 与 ES 卵泡以及二维液滴培养体系，结论不一定直接适用于其他物种、其他品系或其他培养平台。研究也提示，二维培养体系可能不适合 PM 卵泡，PM 卵泡的体外培养条件仍需进一步探索。在类似研究中，把卵泡发育阶段与 FSH 浓度同时作为变量，并用受体表达、增殖指标、激素分泌和成熟率多层数据交叉验证，比单纯依赖成熟率单一终点更稳妥。
文献信息
Wang X, Wang L, Sun Y, et al. The optimized research of the in vitro culture of preantral follicles in mice. J Clin Lab Anal. 2020. PMID: 33463764. DOI: 10.1002/jcla.23498.