结核病由结核分枝杆菌复合群（MTBC）病原体引起，其致病机制与宿主免疫代谢重塑密切相关。本研究以牛分枝杆菌（M. bovis）为模型，发现 frd 操纵子 7G 同聚体（HT）的插入突变可通过影响延胡索酸还原酶（FRD）活性，减少细菌来源的琥珀酸分泌，进而抑制巨噬细胞 HIF-1α/IL-1β 信号轴，将保护性 Th1 免疫转向致病性 Th17 反应，加剧肺脏病理损伤。研究整合了临床分离株全基因组测序、等基因菌株构建、小鼠感染模型、RNA-seq 与靶向代谢物定量等技术，系统论证了 frd 相位变异在免疫逃逸中的因果作用，为结核病免疫代谢检查点干预提供了新思路。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 临床分离株遗传变异筛查 | 全基因组测序（WGS）与生物信息分析 | 鉴定 frd 操纵子 7G HT 的插入突变频率与地理分布 | M. bovis（n=74）及 M. tb（n=2819）分离株的突变图谱，8G/9G HT 等位基因频率 |
| FRD 蛋白结构预测与分子对接 | AlphaFold2 结构预测、AutoDock 分子对接 | 评估 8G HT 插入对 FRD 与甲萘醌（MQ9）结合的影响 | WT 与 8G 突变体的三维结构模型，MQ9 对接构象及结合口袋的空间位阻信息 |
| 等基因菌株构建与体外功能验证 | 噬菌体介导的特异性转导、质粒回补、低氧培养 | 明确 frd 缺失或 8G 插入对细菌琥珀酸分泌与生长的影响 | Δfrd、Δfrd::frd7G、Δfrd::frd8G 菌株的琥珀酸分泌水平，生长曲线与菌落形态 |
| 小鼠感染模型与免疫表型分析 | 鼻内感染、组织载菌量测定、组织病理切片、流式细胞术、ELISA | 评估 frd 突变体在体内的致病力及 T 细胞极化方向 | 肺脾指数、CFU、HE 染色图像、引流淋巴结 CD4+ T 细胞 IFN-γ/IL-17A 比例、血清细胞因子水平 |
| 巨噬细胞转录组与代谢组分析 | RNA-seq、UHPLC-QTRAP LC-MS/MS 靶向代谢组学 | 揭示 frd 突变对宿主巨噬细胞糖酵解和炎症信号通路的影响 | 差异表达基因（DEGs）列表、KEGG 通路富集、胞内 TCA 循环代谢物（琥珀酸、柠檬酸等）浓度 |
| 信号通路机制验证 | Western blot、免疫荧光、ELISA、HIF-1α 抑制剂 YC-1 处理、IL-1R 阻断抗体 | 验证琥珀酸/HIF-1α/IL-1β 轴在 frd 突变免疫调节中的因果关系 | HIF-1α 蛋白表达量、IL-1β 分泌量、乳酸产生量、使用 YC-1 或抗 IL-1R 抗体后的表型回复数据 |
关键环节
基于全基因组测序的相位变异鉴定
研究首先对 74 株临床 M. bovis 分离株进行全基因组测序，发现 frd 操纵子 frdB 基因末端 7G HT 区域存在高频 G 插入突变，其中 56.8% 的分离株表现为单个 G 插入形成 8G HT，而仅有 6.8% 保留野生型 7G HT；对 GMTV 数据库 2819 株 M. tb 基因组的分析同样检测到类似插入，提示该变异在 MTBC 中保守存在。此环节依赖于高通量测序平台与生物信息学流程（包括 fastp、BWA、Pilon 等），明确了临床菌株中 frd 相位变异的普遍性，为后续功能研究提供了遗传学基础。
结构预测与分子对接提示功能损伤
为评估 8G 插入对 FRD 蛋白功能的影响，研究者利用 AlphaFold2 预测野生型与突变型 FRD 的三维结构，并通过 AutoDock 将甲萘醌 MQ9 对接到蛋白结构中。结果显示，8G HT 插入导致 FrdB-FrdC 读框内融合，融合肽段恰好占据 MQ9 结合口袋，可能阻碍电子传递。这一结构模拟为推测突变导致 FRD 酶活性降低提供了分子依据，但并不代替实验验证，需要后续功能实验加以确认。
等基因菌株构建与低氧琥珀酸分泌实验
为排除临床分离株其他遗传背景的干扰，研究通过噬菌体介导的特异性转导构建了 M. bovis Δfrd 敲除株，并利用 pMV361 质粒分别回补野生型（7G HT）与突变型（8G HT）frd 操纵子，获得等基因菌株 Δfrd::frd7G 和 Δfrd::frd8G。低氧培养后检测培养上清中琥珀酸含量，结果显示 Δfrd 和 Δfrd::frd8G 的琥珀酸分泌显著低于 WT 与 Δfrd::frd7G，而体外生长曲线和菌落形态无显著差异。该实验直接证明 8G 插入削弱了 FRD 催化延胡索酸还原为琥珀酸的能力，且该效应并非由生长差异引起，为下游宿主免疫代谢研究奠定了菌株基础。
小鼠感染模型揭示致病力增强与 Th17 极化
使用临床分离株（Iso 7G vs Iso 8G）及等基因菌株感染 C57BL/6 小鼠，在感染后 12 天和 22 天进行组织载菌量测定、组织病理分析和流式细胞术。结果显示，frd 突变株（Iso 8G、Δfrd、Δfrd::frd8G）感染导致更严重的体重下降、更高的肺脏载菌量以及肺组织中中性粒细胞为主的坏死性炎症；而 WT 与 frd7G 回补株感染以淋巴细胞浸润为主，未出现明显坏死。流式细胞术检测引流淋巴结中 CD4+CD69+ T 细胞，frd 突变株感染组 IFN-γ+ 细胞比例下降，IL-17A+ 细胞比例升高，血清中 IFN-γ 降低而 IL-17A 升高，表明体内免疫应答由 Th1 向 Th17 偏移。此过程利用了流式细胞仪（Fortessa X-20）及 ELISA 读板机，建立了从组织表型到免疫细胞极化的证据链条，支持 frd 突变增强致病力并主要通过改变 T 细胞应答方向实现。
巨噬细胞转录组与代谢组分析揭示糖酵解抑制
为探讨 frd 突变影响宿主免疫的分子机制，研究对感染 WT 或 Δfrd 的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）进行 RNA-seq 分析，发现 Δfrd 感染下调缺氧反应、固有免疫相关基因，并上调中性粒细胞趋化和 IL-17 信号通路，同时 Gapdh 表达显著下调，提示糖酵解受损。进一步采用 UHPLC-QTRAP LC-MS/MS 对感染不同菌株的 BMDMs 进行靶向代谢物定量，发现 Δfrd 与 Δfrd::frd8G 感染细胞内 TCA 循环代谢物（如琥珀酸、柠檬酸）以及乳酸水平显著低于 WT 与 frd7G 回补组，同时 Ldha 和 Nos2 的表达模式也呈现相应变化。这一代谢组学证据将细菌 frd 突变与宿主糖酵解抑制直接联系起来，说明 frd 相位变异通过削弱细菌琥珀酸分泌，影响了巨噬细胞的免疫代谢重编程。
琥珀酸/HIF-1α/IL-1β 信号轴的机制验证
Western blot 与免疫荧光实验显示，WT 与 frd7G 回补菌株感染可诱导 BMDMs 中 HIF-1α 蛋白持续积累，而 Δfrd 与 frd8G 突变株则显著削弱该积累；同时细胞外乳酸和 IL-1β 水平也随菌株而异。使用 HIF-1α 抑制剂 YC-1 处理 BMDMs 后，不同菌株感染引起的乳酸与 IL-1β 分泌差异消失，证实 HIF-1α 是 frd 介导免疫代谢调节的关键节点。进一步使用 WT 与 Δfrd 低氧培养上清（其中琥珀酸浓度差异显著）处理 BMDMs，发现 WT 培养上清可诱导更高水平的 HIF-1α 与 IL-1β，说明细菌来源的琥珀酸是激活宿主信号的主要因素。这一部分利用免疫印迹、荧光显微镜及 ELISA 等技术，完成从细菌代谢物到宿主信号通路的机制闭环。
IL-1R 阻断实验验证体内因果性
为验证 IL-1β/IL-1R 信号轴在介导 Th 分化差异和病理后果中的必要性，研究在小鼠感染模型中给予抗 IL-1R 抗体或同型对照。结果显示 IL-1R 阻断可消除 M. bovis WT 与 Δfrd 感染之间 CD4+ T 细胞 IFN-γ/IL-17A 比例的差异，并加重 WT 菌株感染导致的肺脏载菌量和炎症面积，组织学表现也转变为中性粒细胞为主的坏死性炎症，与 frd 突变株感染的表型相似。此实验采用流式细胞术与组织病理技术，明确了 frd 突变体通过抑制 IL-1β 信号而下调 Th1 免疫、促进 Th17 病理反应，证实了体内因果链路。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 遗传变异 → 结构预测 | 全基因组测序、AlphaFold2 结构预测、AutoDock 分子对接 | WGS 鉴定出高频 7G HT 插入突变后，利用结构预测与对接评估突变对蛋白功能的影响，为后续实验提供分子假设。 |
| 菌株构建 → 功能验证 | 噬菌体转导、质粒回补、低氧培养、LC-MS/MS 代谢物检测 | 等基因菌株排除了背景干扰，低氧培养模拟宿主微环境，代谢物检测直接量化琥珀酸分泌差异，建立基因型与生化表型的因果关系。 |
| 体内动物模型 → 免疫表型 | 小鼠感染、组织病理、流式细胞术、ELISA | 动物模型提供整体病理和载菌量证据，流式与 ELISA 将组织表型与 Th1/Th17 极化联系起来，明确免疫学后果。 |
| 转录组+代谢组 → 通路假设 | RNA-seq、UHPLC-QTRAP LC-MS/MS | RNA-seq 揭示糖酵解基因和免疫信号通路的变化，代谢组定量验证糖酵解与 TCA 代谢物水平，结合提示琥珀酸作为信号分子发挥作用。 |
| 机制验证 → 反向验证 | 抑制剂 YC-1、抗 IL-1R 抗体、Western blot、ELISA | 使用通路抑制剂和中和抗体干扰信号轴，观察表型变化是否依赖于 HIF-1α 和 IL-1R，实现因果验证。 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 研究细菌基因相位变异如何影响宿主免疫代谢 | 全基因组测序 + AlphaFold2 + 等基因菌株构建 + RNA-seq + 靶向代谢组学（UHPLC-MS/MS） | 该组合可系统鉴定临床菌株中的相位变异热点，在蛋白结构层面预测功能后果，并通过同源重组构建等基因菌株排除背景干扰，最后用转录组和代谢组联合揭示宿主应答变化，形成从基因型到表型的完整证据链。前提是需要样本量和遗传操作工具。 |
| 解析细菌代谢物对宿主信号通路的影响 | 低氧培养 + LC-MS/MS 代谢物定量 + Western blot + 抑制剂/中和抗体 | 通过细菌培养上清或代谢物补充实验，结合信号通路抑制剂，可在细胞水平验证特定代谢物的功能。适合研究宿主-病原互作中的代谢信号，但应确认代谢物浓度处于生理范围，并且抑制剂特异性需经过验证。 |
| 评估免疫表型与疾病结局的相关性 | 小鼠感染模型 + 流式细胞术 + 组织病理 + 细胞因子 ELISA | 将体内载菌量、炎症面积等病理指标与 T 细胞极化及细胞因子水平关联，可以确定免疫应答方向对疾病进程的影响。尤其适用于需要区分 Th1/Th17 或保护性/致病性免疫的研究。需要足够的小鼠样本量和可重复的流式染色方案。 |
本研究的技术流程体现了从“临床菌株中发现变异”到“结构预测提示后果”，再到“等基因菌株验证功能”，随后利用“多组学手段揭示宿主代谢变化”，最后通过“药理或抗体干预进行因果验证”的完整逻辑，为研究病原菌相位变异调控宿主免疫代谢提供了可借鉴的方法框架。需要注意，具体组合的选择依赖研究对象的可操作性，例如分枝杆菌的遗传操作周期较长，需要预留足够时间；代谢组学需针对样品基质和检测目标优化前处理，以准确反映靶向代谢物的水平。
文献信息
Dong Y, Ge X, Guo Q, et al. Mycobacterium bovis frd operon phase variation hijacks succinate signaling to drive immunometabolic rewiring and pathogenicity. Nature Communications, 2025. DOI: 10.1038/s41467-025-61824-9