牙乳头（DP）是牙本质和牙髓发育的基础，其内部细胞高度异质，但关键细胞亚群尚不清楚。本研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析人牙乳头细胞图谱，结合流式分选、体外功能实验和体内异位牙髓再生模型，鉴定出GLDN+细胞为具有自我更新、迁移、成牙本质分化及促血管生成能力的成牙本质干细胞（OSCs）。机制上，GLDN通过自分泌和旁分泌方式维持BMP5表达，激活P-SMAD1/5/9信号通路，调控干细胞功能和血管形成。整个研究以scRNA-seq为起点，流式分选为分离验证工具，功能实验和体内移植为功能确证，基因沉默和蛋白检测为机制解析，形成了从发现到验证的完整证据链。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 单细胞转录组分析 | scRNA-seq（GSE202476），Seurat、CellPhoneDB等 | 描绘人牙乳头细胞异质性，鉴定关键细胞亚群 | 细胞聚类、UMAP图、标记基因表达、拟时间轨迹、细胞通讯分析 |
| 细胞分选与培养 | 流式分选（FACS），流式细胞分析（BD Accuri C6 Plus） | 从原代牙乳头细胞中分离GLDN+和GLDN-细胞 | 分选后细胞纯度、表面标记表达比例 |
| 体外功能实验 | CCK-8、克隆形成、划痕实验、Transwell迁移实验、ALP染色、茜素红染色、Western blot | 比较GLDN+与GLDN-细胞的自我更新、迁移、成牙本质分化及矿化能力 | 增殖曲线、克隆数、迁移面积、矿化染色强度、蛋白表达量 |
| 促血管生成实验 | HUVEC管形成实验、ELISA | 评估GLDN+细胞条件培养基对血管内皮细胞的影响 | 管状结构参数（结数、网格数、总长度）、BMP5分泌量 |
| 体内牙髓再生模型 | 裸鼠皮下移植，组织学染色（HE、Masson） | 验证GLDN+细胞在体内的牙髓再生能力 | 再生组织切片图像、细胞计数、血管密度、胶原纤维面积 |
| 基因沉默与机制研究 | siRNA转染、qRT-PCR、Western blot、免疫荧光 | 检验GLDN和BMP5在维持干细胞功能和信号传导中的作用 | 基因表达变化、蛋白表达量、信号通路激活水平 |
关键环节
研究首先利用来自公共数据库的scRNA-seq数据（GSE202476）分析人发育期第三磨牙牙乳头，鉴定出11个细胞亚群，其中四个为间充质细胞群。基于标记基因表达和拟时间分析，Cluster 0被定义为TF+/WNT5A+/GLDN+细胞群，处于发育程序的早期阶段，并预测其可分化为成牙本质细胞。此环节使用Seurat包进行聚类和差异表达分析，CellPhoneDB分析细胞间通讯，为后续实验提供了候选标记物GLDN。
为验证GLDN作为功能性标志物的价值，研究从13～22岁患者未完全发育的第三磨牙牙乳头中分离原代细胞，通过流式分选（FACS）获得GLDN+和GLDN-细胞。流式细胞术分析证实分选后GLDN+细胞在P3代时阳性率超过70%，随着传代至P4和P5时降至65.2%和56.9%，说明P3是保持细胞特性的关键时间点。分选后的细胞表达间充质干细胞标记CD44、CD90、CD105，不表达造血/内皮标记CD31、CD34、CD45，证明其是间充质干细胞。此环节通过分选实现标记物验证和细胞富集，为后续功能实验奠定了细胞基础。
体外功能实验显示，GLDN+细胞比GLDN-细胞具有更强的克隆形成能力、增殖速度、迁移能力和矿化潜力。在成骨诱导条件下，GLDN+细胞中牙本质发生相关蛋白DSPP、DMP1和RUNX2的表达水平更高。此外，将GLDN+细胞的条件培养基（CM）作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC），可显著促进其迁移和管状结构形成，提示其促血管生成作用。这些结果验证了GLDN作为干细胞功能标志物的有效性，建立了细胞特性与牙本质/血管形成能力的关联。
为检验体内再生潜能，研究将GLDN+或GLDN-细胞接种于I型胶原凝胶，填充到处理牙本质基质（TDM）管中，植入裸鼠皮下4周。组织学染色显示，GLDN+细胞组在TDM表面生成更多的成牙本质样细胞，新生牙髓组织中血管网络更密集，胶原纤维面积更大。DSPP/DMP1免疫组织化学染色证实了成牙本质细胞分化，VEGF/CD31标记显示成熟血管区域增加。该模型直接证明了GLDN+细胞在体内能形成具有成牙本质细胞层的血管化牙髓样组织，是支持其作为牙髓再生种子细胞的关键证据。
机制层面，通过siRNA沉默GLDN表达，发现细胞增殖、迁移、矿化和促血管生成能力均受抑，表明GLDN是维持GLDN+干细胞表型所必需的。结合scRNA-seq细胞通讯分析（CellPhoneDB）和KEGG富集，发现TGF-β信号通路显著富集，且BMP5在Cluster 0中特异表达。qRT-PCR和ELISA确认GLDN+细胞分泌高水平的BMP5（超过400 pg/mL），而GLDN-细胞低于200 pg/mL。沉默GLDN减少BMP5表达和分泌，同时降低细胞内P-SMAD1/5/9水平。进一步沉默BMP5或补充外源重组BMP5蛋白，分别抑制或促进细胞增殖、迁移、矿化及血管生成能力，证实GLDN通过调控BMP5/P-SMAD1/5/9轴以自分泌和旁分泌方式维持干细胞功能并调节内皮细胞行为。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 发现与验证 | scRNA-seq → 流式分选 | scRNA-seq锁定GLDN为候选标记，流式分选分离GLDN+细胞进行功能验证。 |
| 互补 | 体外功能实验 + 体内移植模型 | 体外实验检测细胞内在特性，体内模型验证实际再生能力，两者互为补充。 |
| 机制解析 | siRNA沉默 + Western blot/ELISA | 基因沉默联合蛋白检测揭示GLDN通过BMP5/P-SMAD1/5/9通路的调控机制。 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 从组织异质性中发现候选干细胞标志物 | scRNA-seq + 拟时间分析 + 流式分选 | scRNA-seq鉴定候选亚群，拟时间分析推测分化关系，流式分选获取纯化细胞以验证标志物特异性。 |
| 验证干细胞再生功能 | 体外功能实验 + TDM体内移植 + 组织学分析 | 体外评估增殖、分化、促血管生成能力，体内模型提供组织学证据，确保功能性验证的完整性。 |
| 阐明分子调控机制 | 细胞通讯分析 + 基因沉默 + 蛋白印迹/ELISA | 转录组数据预测配体-受体互作，基因沉默功能验证，蛋白检测确认信号通路激活状态。 |
需要注意的是，该研究使用的scRNA-seq数据来自公共数据库，分析平台为NovelBrain云平台、CellRanger和Seurat等；应用于其他研究时应考虑数据质量和批次效应。流式分选需要明确标记物在目标组织中的表达比例，并评估传代对细胞表型的影响，特别是涉及干细胞特性维持的问题。基因沉默实验中，siRNA的效率和脱靶效应需要验证，建议设置多个siRNA序列和阴性对照。
文献信息
Liao C, Liu J, Li M, et al. Identification of GLDN+ odontogenic stem cells as crucial for human tooth development and regeneration. International Journal of Oral Science, 2026. DOI: 10.1038/s41368-025-00419-y.