肝细胞癌（HCC）患者合并门静脉癌栓（PVTT）后病情进展迅速且预后极差，其背后的肿瘤免疫微环境（TME）动态变化尚缺乏系统性刻画。本研究整合 GEO 数据库中的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据（10 例原发灶与 2 例 PVTT 样本）以及 TCGA-LIHC 和 ICGC-LIRI-JP 两个 bulk RNA-seq 队列，通过细胞分群、GSVA 富集、差异表达与生存分析，筛选出 PVTT 相关核心基因，采用多因素 Cox 回归构建风险评分模型，并结合免疫浸润、药物敏感性和体外细胞实验形成完整证据链。核心仪器与技术包括 Seurat 单细胞分析流程、Monocle2 拟时序分析、ConsensusClusterPlus 一致性聚类、CIBERSORT 免疫浸润推断以及 qRT-PCR、Western blot、Transwell 等分子生物学验证手段。
研究发现 PVTT 细胞呈现肿瘤增殖、基质激活和低免疫细胞浸润特征，对应免疫沙漠和免疫排斥样表型，而原发灶细胞则以免疫炎症活动为主。基于核心基因表达模式将患者分为三个亚型，并构建由 PRR11、KIF11、RACGAP1 组成的风险模型，风险评分能独立预测患者生存、化疗及免疫治疗应答，体外实验部分验证了这些基因的促癌功能。整个研究展示了如何将单细胞分辨率和bulk 队列统计功效相结合，形成从发现到验证的生物标志物研究范式。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 单细胞数据质控与分群 | GEO 数据集、Seurat v4.2.0、Harmony、tSNE/UMAP、SingleR、CellMarker 数据库 | 解析 PVTT 与原发灶细胞组成差异 | 40,384 个细胞的八种细胞类型注释及比例矩阵 |
| PVTT 特征细胞鉴定与轨迹分析 | FindAllMarkers、Monocle2、GSVA、Copykat | 区分 PVTT 特异性细胞亚群及恶性演化轨迹 | 三个细胞亚群的标记基因、发育轨迹、通路活性评分 |
| 核心基因筛选 | limma、单因素 Cox 回归、survROC | 缩小候选基因至具有预后价值的核心基因 | TCGA/ICGC 中 ROC>0.7 的 9 个交集基因 |
| 一致性聚类与免疫浸润 | ConsensusClusterPlus、GSVA、CIBERSORT、ESTIMATE、IOBR | 按核心基因表达模式对患者分层并关联 TME 特征 | 三个亚型（A/B/C）的免疫细胞浸润矩阵、基质评分 |
| 预后模型构建 | 多因素 Cox 回归、survminer、时间依赖 ROC、列线图 | 建立可量化风险的风险评分模型 | 包含 PRR11、KIF11、RACGAP1 的公式及 1/2/3 年 ROC 值 |
| 免疫治疗与药物敏感性预测 | oncoPredict、GDSC/CTRP、TCIA/IMvigor 队列 | 检验风险评分对治疗应答的预测能力 | 高/低风险组 IC50 值及免疫治疗反应差异 |
| 体外功能验证 | qRT-PCR、Western blot、IHC、MTT、Transwell、克隆形成、Co-IP | 验证核心基因及转录因子的表达与功能 | mRNA/蛋白表达量、细胞活力、迁移侵袭计数 |
关键环节
PVTT 细胞亚群鉴定与轨迹分析
为明确 PVTT 区别于原发灶的细胞组成特征，研究者先对 scRNA-seq 数据进行质控与批次校正，获得 40,384 个细胞，并注释出肝细胞、T 细胞、B 细胞、NK 细胞等八种类型。PVTT 中恶性肝细胞比例更高，而 T 细胞、NK 细胞等免疫细胞比例下降，提示 PVTT 存在免疫抑制环境。通过两轮聚类从 PVTT 样本中分离出 cluster 0，其富集 DNA 修复、G2M 检查点等增殖相关通路，且 AT2、EMT、血管生成评分升高，炎症与抗原呈递评分降低，符合免疫沙漠/免疫排斥表型。Monocle2 拟时序分析表明 cluster 0 的发育轨迹接近病理 IV 期，恶性程度更高。这里 Seurat 的分群和 GSVA 评分是从单细胞层面定义 PVTT 生物学特征的基础，后续基因筛选均建立在 cluster 0 的标记基因之上。
核心基因筛选与模型构建
在单细胞标记基因基础上，整合 TCGA 与 ICGC 的 bulk 转录组差异表达和单因素 Cox 分析，取交集得到 36 个候选预后基因，再以 ROC>0.7 为标准进一步筛出 9 个核心基因（MYBL2、PRR11、MCM2 等），它们在肿瘤中均高表达且与不良生存相关。随后，将 9 个核心基因的表达量作为连续变量，通过多因素 Cox 回归选择 PRR11、KIF11、RACGAP1 构建风险评分公式。这一环节体现了「单细胞定位特征基因→bulk 队列统计筛选→多因素回归压缩维度」的思路，风险评分在训练集 TCGA 中 1/2/3 年 AUC 为 0.74/0.694/0.665，在验证集 ICGC 中为 0.764/0.756/0.776，说明模型具备一定的泛化能力。
免疫微环境关联分析
为理解核心基因表达模式如何与 TME 相互作用，作者用 ConsensusClusterPlus 按 9 个基因将 TCGA 患者分为三个亚群，并比较亚群间的 GSVA 通路活性和免疫浸润差异。CIBERSORT 和 IOBR 分析显示，cluster B 以基质激活和固有免疫细胞浸润为主，cluster C 呈免疫沙漠表型，cluster A 则介于两者之间且具有较高免疫循环评分。这些亚型的预后差异（B 最佳、C 最差）提示核心基因表达模式与 TME 状态密切相关，为后续风险评分的生物学解释提供依据。同时，风险评分与 TMB、MSI 正相关，并在四个独立免疫治疗队列中显示高风险组对 PD-1/CTLA-4 抑制剂更敏感，表明模型可能具有治疗指导价值。
体外功能验证
针对风险模型中的三个基因及其预测的共同转录因子 YY1、CREB1，研究者收集 HCC 临床组织样本，通过 IHC 和 Western blot 确认它们在肿瘤组织中的高表达，并在多种 HCC 细胞系（HepG2、HCC-LM3、Huh-7 等）中验证 mRNA 和蛋白水平。功能实验表明，过表达 PRR11、KIF11、RACGAP1 可增强细胞活力、克隆形成、迁移和侵袭能力，而敲低则相反。Co-IP 实验证实 KIF11 与 RACGAP1 存在蛋白互作，转录因子 YY1、CREB1 的过表达或敲低能够相应上调或下调三个模型基因的 mRNA 表达。这些结果从湿实验层面支撑了生物信息学预测的可靠性，使证据链从关联推进到功能验证。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 互补关系 | scRNA-seq（Seurat/GSVA）与 bulk RNA-seq（limma/Cox） | 单细胞提供细胞异质性信息，bulk 队列提供统计功效和生存关联，两者结合实现从单细胞特征到预后模型的转化。 |
| 验证关系 | 生物信息学模型与分子生物学实验（qRT-PCR、Western blot、IHC） | 转录组层面的表达和功能预测，通过临床组织样本和体外细胞实验予以独立验证。 |
| 延伸关系 | 多因素 Cox 回归与免疫浸润分析（CIBERSORT、ESTIMATE） | 风险评分不仅用于生存预测，还与 TME 细胞比例和免疫特征关联，提供机制性解释。 |
| 预测链条 | 风险模型与 oncoPredict/免疫治疗队列 | 同一模型延伸至化疗药物敏感性和免疫治疗反应预测，扩大临床转化应用范围。 |
技术协同体现在数据来源的匹配上。scRNA-seq 分析需要专门的质控、批次校正和聚类工具（Harmony、Seurat），而 bulk 数据则依赖标准差异表达和生存分析包（limma、survival）。本研究并未在同一平台上完成全部步骤，而是以「单细胞定义特征基因→bulk 验证预后→模型延伸至治疗预测」为主线，形成合理的数据互补。需要注意的是，单细胞样本量较小（10 例 PT、2 例 PVTT），作者通过后续 bulk 队列扩大样本量来弥补，这一策略在类似研究中尤其重要。
研究组合
对于旨在建立预后或分型标志物的研究，可参考以下组合：若研究对象已有公共 scRNA-seq 数据，可采用「Seurat 分群 + FindAllMarkers 获取亚群标记基因」确定疾病特异性细胞群；若无直接对应数据，可借助差异表达分析锁定候选基因，再用多因素 Cox 回归构建模型。该组合适用于肿瘤异质性明显、需要结合单细胞分辨率与队列统计功效的场景。对于仅拥有 bulk 转录组数据的课题组，替代方案是单独使用 limma 和生存分析筛选预后基因，但需注意此时无法将基因定位至特定细胞类型，解释力度弱于本研究范式。
体外验证部分并非必需，但能显著增强标志物研究的说服力。本研究中组合了常规表达检测（qRT-PCR、Western blot、IHC）与功能实验（MTT、Transwell、克隆形成、Co-IP），实验周期和成本明显增加。前提是需要具备相应的细胞培养平台和抗体资源。对于以生信分析为主的团队，至少应考虑使用临床样本或独立数据集进行表达验证（如 HPA 数据库），以支撑模型的可靠性。
当研究目标聚焦于免疫治疗反应预测时，可参考本研究的免疫浸润反卷积（CIBERSORT）联合免疫治疗队列（如 IMvigor210）的做法。需要注意的是，不同免疫治疗队列的患者来源、癌种和治疗方案差异较大，直接跨癌种验证可能引入混杂因素，应选择与研究对象匹配的队列或谨慎解释结果。药物敏感性预测方面，oncoPredict 利用 GDSC 等数据库计算 IC50 的值，其分析结果受到数据库药物覆盖范围的限制，筛选出的药物通常需要后续实验验证。
本研究采用的降维算法和聚类参数并非唯一选择，例如批次校正也可使用 Seurat 自带的整合流程。对实验人员而言，更稳妥的理解是：任何生物信息学工具产生的结果都需要在独立数据或湿实验中复核，单细胞和 bulk 数据整合的强度依赖于两者批次效应的正确消除和样本量的代表性。
文献信息
Tong W, Zhong J, Yang Q, et al. Single-cell and bulk transcriptomic datasets enable the development of prognostic models based on dynamic changes in the tumor immune microenvironment in patients with hepatocellular carcinoma and portal vein tumor thrombus. Front Immunol, 2024, 15:1414121. doi: 10.3389/fimmu.2024.1414121. PMID: 39530087.