本研究在包含2412例多民族参与者的Dallas Heart Study二期队列中，通过ELISA定量血浆calprotectin，结合Cox比例风险模型评估其与8年动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）事件的关联。随后，研究利用培养的人冠状动脉内皮细胞，采用流式细胞术和Incucyte活细胞成像系统，从内皮完整性、一氧化氮生成及内皮间质转化等角度探索calprotectin的致病机制。ELISA提供的人群关联证据与体外功能性实验共同构成从观察到机制的完整证据链。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 血浆calprotectin定量 | Human S100A8/S100A9 Heterodimer DuoSet ELISA（R&D Systems），Cytation 5酶标仪 | 在大样本人群中准确测量calprotectin浓度 | 2412例血浆calprotectin浓度（ng/mL） |
| ASCVD事件关联分析 | Cox比例风险模型（SAS 9.4） | 评估calprotectin与未来ASCVD事件的独立关联 | 风险比（HR）及95%置信区间 |
| 冠状动脉钙化评估 | 多排螺旋CT（Agatston评分） | 分析calprotectin与冠状动脉钙化的关系 | CAC评分 |
| 内皮细胞基因表达分析 | 逆转录定量PCR | 检测calprotectin对内皮标志物基因表达的影响 | CD31和von Willebrand factor基因表达量 |
| 一氧化氮生成检测 | 流式细胞术（DAF-FM diacetate荧光探针） | 评估calprotectin对内皮细胞NO合成的影响 | NO荧光强度（MFI） |
| 细胞迁移与增殖监测 | Incucyte S3活细胞成像系统及Woundmaker | 实时观察calprotectin对内皮细胞迁移和增殖的作用 | 随时间变化的伤口愈合百分比和细胞计数 |
| 内皮间质转化表型鉴定 | 流式细胞术（CD31、α-SMA、transgelin标记） | 验证calprotectin是否诱导EndoMT | CD31+α-SMA+及CD31+transgelin+细胞比例 |
关键环节
血浆calprotectin定量与人群关联
该环节旨在解决calprotectin是否与ASCVD风险相关的问题。研究使用Human S100A8/S100A9 Heterodimer DuoSet ELISA试剂盒，在Cytation 5多功能酶标仪上读取吸光度。ELISA方法的选择基于calprotectin作为S100A8/S100A9异二聚体的稳定性，以及其在血浆中的可检测性。检测限为0.0938 ng/mL，批内变异系数2.7%，批间变异系数5.8%，在低浓度样本中批间CV为10.8%，处于可接受范围。这些质量控制数据确保了后续统计分析的可靠性。ELISA定量结果作为连续变量和四分位分组变量，用于Cox回归分析。在调整传统危险因素及hs-CRP、NT-proBNP、hs-cTnT后，calprotectin仍与ASCVD事件显著相关（HR 1.43，95% CI 1.04-1.96），支持其作为独立生物标志物的潜力。
内皮细胞功能评估
为解释人群关联的生物学机制，研究使用重组calprotectin处理人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）。流式细胞术使用DAF-FM diacetate荧光探针检测细胞内NO水平，该探针特异性结合NO并产生荧光，通过平均荧光强度反映NO生成量。结果显示calprotectin处理后NO产生显著减少，且在氧化应激条件下更为明显。同时，逆转录定量PCR显示内皮标志物CD31和vWF基因表达下调。这些数据表明calprotectin直接损伤内皮功能，为ASCVD风险增加提供了机制解释。
迁移与增殖动态监测
Incucyte S3活细胞成像系统用于实时监测细胞迁移和增殖。实验使用ImageLock 96孔板，通过Woundmaker制造划痕，每2小时自动成像，持续24小时。软件量化伤口愈合百分比和细胞计数。calprotectin处理组伤口愈合速度显著加快，细胞增殖增加，提示内皮细胞向间充质表型转化。该技术提供了时间序列的动态数据，避免了传统终点法的信息丢失，是评估细胞行为变化的有效工具。
内皮间质转化表型验证
流式细胞术进一步验证EndoMT。细胞经calprotectin处理后，使用CD31标记内皮细胞，并在固定透化后检测α-SMA和transgelin（间充质标志物）。门控策略先圈定CD31阳性细胞，再分析其中α-SMA或transgelin双阳性比例。结果显示calprotectin显著增加CD31+α-SMA+和CD31+transgelin+细胞群，证明其诱导EndoMT。流式细胞术的多参数分析能力使其能够同时检测多个标志物，是鉴定细胞表型转化的合适选择。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 互补 | ELISA与Cox回归 | ELISA提供calprotectin定量数据，Cox回归将其与临床终点关联，形成流行病学证据 |
| 验证 | 流式细胞术与逆转录定量PCR | 基因表达下调与蛋白水平变化相互印证，确认calprotectin对内皮标志物的影响 |
| 扩展 | Incucyte活细胞成像与流式细胞术 | Incucyte动态观察迁移增殖，流式细胞术鉴定表型，共同支持EndoMT机制 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 发现并验证循环生物标志物 | ELISA定量 + Cox回归 + CT钙化评分 | 从大队列中筛选候选标志物，并提供独立预测价值及亚临床动脉粥样硬化关联证据 |
| 机制探索 | 细胞培养 + 流式细胞术 + 活细胞成像 + qPCR | 从功能表型到分子机制的多维度验证，解释人群关联的生物学基础 |
需要注意的是，上述组合适用于假设驱动的研究设计，且需要相当规模的人群样本和体外实验条件。ELISA的优劣取决于抗体特异性和样本基质，流式细胞术需优化荧光补偿和门控策略，活细胞成像则要求稳定的培养环境。在类似研究中，应根据目标标志物的性质和机制假设选择合适的技术层级。
文献信息
Zuo Y, NaveenKumar SK, Navaz S, et al. Epidemiological and Translational Study of Calprotectin and Atherosclerotic Cardiovascular Disease. JAMA Cardiology. 2025;10(7). doi:10.1001/jamacardio.2025.0945