该研究以 Aβ 诱导的阿尔茨海默病（AD）小鼠模型和脂多糖（LPS）诱导的 BV-2 小胶质细胞炎症模型为对象，评价 Jiaohong pills（JHP）对神经炎症和认知功能障碍的改善作用。实验先通过 CCK-8 和 Griess 法确定药物安全浓度及对一氧化氮（NO）的影响，再用 ELISA 检测炎症因子，Western blot 检测 p-p38 MAPK、p-p65 NF-κB 及 iNOS 的蛋白表达，并采用 Morris 水迷宫和 Nissl 染色验证整体药效，形成从分子到行为的完整证据链。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 细胞毒性筛查 | CCK-8 试剂盒、酶标仪 | 确定 PZ 和 RR 的安全给药浓度范围 | 细胞存活率 |
| NO 释放检测 | Griess 试剂盒、酶标仪 | 评价 PZ/RR 对 LPS 诱导的 NO 释放的抑制作用 | NO 浓度 |
| 炎症因子检测 | ELISA 试剂盒、酶标仪 | 定量炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-10 的水平变化 | 细胞上清及皮层组织炎症因子浓度 |
| 通路蛋白检测 | Western blot（SDS-PAGE 电泳、转膜、化学发光成像） | 测定 iNOS、p-p38 MAPK、p-p65 NF-κB 的蛋白水平 | 蛋白条带灰度值 |
| 神经行为学评价 | 旷场实验、Morris 水迷宫（含视频跟踪系统） | 评价 JHP 对 AD 小鼠学习记忆能力的影响 | 探索路程、穿越平台次数、逃避潜伏期等 |
| 神经元损伤评价 | Nissl 染色（甲苯胺蓝、焦油紫） | 观察海马 CA1/CA3 区神经元存活和尼氏体变化 | 神经元数量、尼氏体染色深度 |
关键环节
细胞模型与药物浓度设定
在体内实验前，作者先以 BV-2 小胶质细胞为模型，用 LPS 诱导炎症，并检测 PZ 和 RR 的细胞毒性。CCK-8 法显示 PZ 在 25 μg/mL 以内、RR 在 50 μg/mL 以内对细胞无明显毒性。随后 Griess 法发现 PZ 在 3.125～50 μg/mL 范围内呈剂量依赖地抑制 LPS 诱导的 NO 释放，而 RR 无此作用。此环节为后续机制实验限定药物浓度，避免细胞毒性干扰药效判断。
炎症因子的定量检测
在细胞上清和 AD 小鼠皮层组织中，用 ELISA 检测 TNF-α、IL-1β 和 IL-10。结果显示 LPS 或 Aβ 刺激显著升高促炎因子、降低抗炎因子，而 PZ 或 JHP 干预逆转这些变化。ELISA 提供的是可定量的蛋白浓度数据，用于证明 JHP 的抗炎作用不仅限于单一靶点，而是整体调节促炎/抗炎平衡。
MAPK/NF-κB 通路蛋白验证
Western blot 用于检测 iNOS、p-p38 MAPK、p-p65 NF-κB 的表达。结果显示 LPS 显著上调这些蛋白，PZ 干预后 p-p38 MAPK 和 p-p65 NF-κB 水平呈剂量依赖性下降。这为 JHP 的药效提供了分子机制层面的证据，说明其抗炎作用与抑制 MAPK/NF-κB 信号通路相关。
动物模型与整体药效评价
采用 Aβ25-35 侧脑室注射建立 AD 小鼠模型，JHP 按低、中、高剂量灌胃给药，并以多奈哌齐为阳性对照。旷场实验用于排除药物对自发活动的影响，Morris 水迷宫则专门评价空间学习记忆能力。数据显示 JHP 中高剂量可显著增加目标象限游泳时间比例和穿越平台次数，缩短逃避潜伏期，说明 JHP 能改善 Aβ 引起的认知缺陷。
海马神经元形态学观察
Nissl 染色用于观察海马 CA1 和 CA3 区神经元形态。Aβ 模型组神经元排列紊乱、尼氏体减少，JHP 干预后存活神经元数量显著增加，尼氏体染色加深。该数据将行为学改善与海马结构完整性的恢复联系起来，支持 JHP 对神经元损伤的保护作用。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 剂量确定与效应评价 | CCK-8、Griess 法 | CCK-8 排除毒性浓度，Griess 法在安全范围内观察药效，为下游实验设定合理浓度梯度。 |
| 分子机制与表型验证 | ELISA、Western blot、Nissl 染色 | ELISA 和 Western blot 分别从分泌蛋白和胞内信号蛋白层面验证抗炎机制，Nissl 染色将分子事件延伸至组织病理结构。 |
| 药效与行为关联 | Morris 水迷宫、Nissl 染色 | 水迷宫反映学习记忆能力，Nissl 染色反映神经元存活状态，两者相互印证认知改善的组织学基础。 |
| 体内外模型互补 | LPS 诱导的 BV-2 细胞、Aβ 诱导的 AD 小鼠 | 体外实验确认抗炎作用及通路蛋白变化，体内实验验证整体药效和认知保护，二者共同构成 JHP 药效的证据链。 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 中药复方抗炎机制研究 | 细胞活力检测（CCK-8）+ Griess 法 + ELISA + Western blot | 从细胞毒性、效应分子、炎症因子和通路蛋白四个层面系统评价药物的抗炎作用，前提是需要先确定安全浓度范围。 |
| 认知障碍动物模型的药效评价 | 旷场实验 + Morris 水迷宫 + Nissl 染色 | 旷场实验排除运动能力干扰，水迷宫测试空间记忆，Nissl 染色提供病理学证据，三者在行为与结构层面互相验证。 |
| 通路机制的验证性研究 | Western blot 检测磷酸化蛋白（如 p-p38、p-p65），必要时结合免疫组化 | 磷酸化蛋白水平的半定量分析可确认通路是否被干预，但其结果需与下游炎症因子水平和功能学指标关联，避免单点推断。 |
需要注意，该研究中的 ELISA、Western blot 和 Nissl 染色等方法均依赖具体检测试剂盒和抗体，实验时需要根据样品类型和检测目的选择合适的试剂与抗体组合。此外，体内外实验的剂量换算关系需参照药理实验规范，不同给药途径和模型周期可能影响结果的可比性。
文献信息
Zhang H, Cai W, Dong L, et al. Jiaohong pills attenuate neuroinflammation and amyloid-β protein-induced cognitive deficits by modulating the mitogen-activated protein kinase/nuclear factor kappa-B pathway. Animal Model Exp Med, 2024. PMID: 38177948. DOI: 10.1002/ame2.12369.