在广泛期小细胞肺癌（ES-SCLC）免疫联合化疗的疗效预测研究中，ASTRUM-005试验的探索性生物标志物分析整合了定量血清蛋白组学、肿瘤组织靶向DNA测序和常规血液参数检测，形成了从分子表型到临床结局的证据链。该研究使用Olink Explore 3072平台对168例患者血清进行蛋白组检测，结合Med1CDx靶向panel对305例患者肿瘤组织进行基因测序，分别识别出与疗效相关的15蛋白签名及RB1/Notch通路基因突变，并验证了基线NLR和LDH的预后价值。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 血清蛋白组检测 | Olink Explore 3072（邻位延伸技术，Illumina NovaSeq 6000测序） | 筛选应答者与非应答者间的差异表达蛋白（DEP） | 2925种血清蛋白的相对表达量（NPX值） |
| 肿瘤组织DNA提取与质控 | QIAamp FFPE DNA提取试剂盒、Qubit 3.0、Nanodrop 8000、琼脂糖凝胶电泳 | 获得高质量肿瘤DNA用于靶向测序 | DNA浓度、纯度（A260/280、A260/230）及完整性数据 |
| 靶向基因测序 | Med1CDx panel（601基因）、Covaris M220片段化、NEBNext Ultra II文库构建、Illumina NovaSeq 6000测序 | 检测肿瘤组织中的基因突变及MSI状态 | FASTQ测序数据，经生物信息分析得到基因突变谱与MSI状态 |
| 生物信息学分析 | fastp、BWA、Samtools、Picard、Varscan、ANNOVAR、maftools | 识别高频突变基因、构建突变矩阵并去除离群样本 | 基因突变列表（VCF格式）、突变频率、PCA分析结果 |
| 蛋白签名构建与验证 | 广义线性模型（5折交叉验证）、ROC曲线、Youden指数 | 构建并验证15蛋白签名以预测疗效 | 15蛋白签名评分、ROC-AUC值、最佳cutoff值 |
| 疗效关联分析 | Cox比例风险模型、Kaplan-Meier曲线、X-tile | 评估蛋白签名、基因突变和血液参数与ORR、OS和PFS的关系 | HR、95%CI、P值、亚组生存曲线 |
关键环节
1. 血清蛋白组检测：发现差异蛋白并构建预测签名
Olink Explore 3072基于邻位延伸技术，通过寡核苷酸标记的抗体对识别目标蛋白，阳性信号经PCR扩增后进行二代测序定量。在168例具有可用血样的患者中，该平台一次检测可同时定量近3000种蛋白，仅需2.8μL血清，满足临床试验中有限样本的高通量蛋白组分析需求。测序数据经Olink NPX manager处理，转换为相对定量单位NPX，并利用内参和板间对照校正批次效应。随后通过比较血清plulimab组内应答者与非应答者的蛋白表达，筛选出在治疗组有显著差异而在安慰剂组无差异的候选蛋白，最终经回归分析确定15个非零回归系数的蛋白构成签名。训练集中该签名的ROC-AUC达0.982，验证集为0.918，表明蛋白组数据能有效区分免疫联合化疗的获益人群。
2. 肿瘤组织靶向测序：识别RB1和Notch通路突变
肿瘤组织DNA经QIAamp试剂盒提取，通过Qubit和Nanodrop进行浓度与纯度质控，确保DNA质量满足测序要求。文库构建采用NEBNext Ultra II试剂盒结合Covaris M220片段化，使用覆盖601个基因的Med1CDx panel进行靶向捕获，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端150bp测序。生物信息分析流程包括fastp质控、BWA比对至hg19参考基因组，以及Varscan变异检测。分析结果显示，ES-SCLC患者的TP53和RB1突变频率分别为90.1%和68.2%，与既往研究一致。在免疫联合化疗组中，携带RB1突变或Notch通路（NOTCH1-4）突变的患者ORR、OS或PFS更优，提示这些基因突变可能作为预测免疫治疗疗效的潜在标志物。
3. 常规血液参数：验证NLR和LDH的预后价值
研究还评估了583例患者的基线NLR和PLR以及582例患者的LDH水平。通过X-tile确定最佳cutoff值，并结合Cox多因素回归分析发现，高NLR（>4.6）和高LDH（>正常上限）是ES-SCLC患者OS和PFS的独立预后不良因素（P=0.002和P<0.001）。这一结果说明，在蛋白组和基因组标志物之外，低成本的常规血液参数仍具有独立的预后判断价值，可作为临床易获取的补充指标。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 互补 | Olink Explore 3072 与 Med1CDx panel 测序 | 蛋白组学提供循环蛋白层面的疗效预测标志物，基因组学提供肿瘤组织基因突变信息，两者分别覆盖肿瘤微环境与肿瘤细胞内在特征的互补维度。 |
| 递进验证 | 血清蛋白组筛选 → 回归建模 → 独立验证集ROC评估 | 15蛋白签名先经训练集构建，随后在独立验证集及安慰剂对照集（控制验证集）中验证预测能力，形成递进式证据链。 |
| 独立确认 | X-tile与Cox回归在常规血液参数分析中的使用 | 通过X-tile确定连续变量的最佳分层cutoff，再用多因素Cox回归确认NLR和LDH的独立预后作用，避免了单一统计方法的局限性。 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 探索免疫联合化疗的疗效预测标志物 | Olink Explore 3072 + Med1CDx panel（Illumina NovaSeq 6000测序）+ 常规血液检测 | 同时获得循环蛋白表达谱与肿瘤基因突变状态，并能结合常规血液参数进行预后判断。该组合适用于样本类型多样（血清+肿瘤组织）的临床队列研究。 |
| 建立可重复的多标志物预测模型 | 广义线性模型 + 5折交叉验证 + ROC曲线分析 | 在训练集确定蛋白签名，并在独立验证集和外部对照中评估诊断效能，减少过拟合风险。 |
| 评估已批准药物的伴随标志物 | PD-L1 IHC 22C3（Autostainer Link 48）与基因组/蛋白组标志物并列分析 | 比较不同标志物的预测效能，为临床决策和未来的伴随诊断开发提供参考。 |
需要注意的是，本研究的组合策略建立在临床试验的特定患者人群和样本可用性基础上，其适用前提是具备高质量FFPE肿瘤样本与基线血清样本。此外，蛋白组分析样本量相对较小（168例），蛋白签名的验证仍需更大规模的独立队列确认。
文献信息
Cheng Y, Zhang S, Han L, et al. First-line serplulimab plus chemotherapy in extensive-stage small-cell lung cancer: Updated results and biomarker analysis from the ASTRUM-005 randomized clinical trial. Cancer Commun (Lond). 2025;45(8):990-1009. doi:10.1002/cac2.70032