全基因组关联研究已在胃肠癌中报道超过百个风险相关单核苷酸变异，其中绝大多数位于非编码区。连锁不平衡使每个风险位点内往往存在多个同等可能的候选变异，仅凭关联信号难以确定因果变异及其靶基因。本研究以 H3K27ac HiChIP 为核心，在三种胃肠癌相关细胞模型中同时注释活性启动子与增强子、识别二者之间的染色质互作，并结合 HisTrader 从富集信号中预测核小体缺失区，从而把风险位点内的候选变异压缩到可能的功能变异。研究进一步用 DepMap CRISPR 筛选数据、CRISPRi 和荧光素酶报告基因实验形成证据链，将 rs147518036 定位到 UXS1 启动子，并验证该变异通过创建 GABPA 识别基序增强启动子活性、影响胃肠癌细胞活力。
研究的技术路线是先在群体遗传层面计算与索引变异强连锁的候选变异，再用 H3K27ac HiChIP 把候选变异限制在活性调控元件及其互作锚点内，用 HisTrader 预测的核小体缺失区进一步缩小范围，最后用功能实验验证候选变异对转录因子结合与靶基因表达的影响。HiChIP 在此承担了连接「非编码调控注释」与「靶基因归属」两个环节的作用，是本研究中候选变异筛选与靶基因识别的关键实验基础。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 风险位点与连锁不平衡候选变异确定 | NHGRI-EBI GWAS Catalog 检索、PLINK 计算连锁不平衡、1000 Genomes 基因型数据 | 从已报道的胃肠癌风险索引变异出发，确定各位点内与索引变异强连锁的候选变异范围 | 索引变异清单、各位点连锁不平衡变异清单 |
| 候选位点是否携带选择性癌症依赖基因 | DepMap 全基因组 CRISPR 敲除筛选数据、似然比检验评分 | 评估风险位点是否富集对癌细胞增殖具有选择性依赖的基因，优先关注直接作用于肿瘤发生的位点 | 基因依赖评分、位点富集统计结果 |
| 活性调控元件注释与染色质互作识别 | H3K27ac HiChIP、MboI 酶切、生物素标记补平、超声打断、H3K27ac 抗体富集、链霉亲和素磁珠捕获、Illumina 测序 | 在胃肠癌相关细胞模型中同时注释活性启动子与增强子，并识别增强子-启动子及启动子-启动子互作 | 染色质互作数据、H3K27ac 富集信号、互作锚点 |
| 候选变异与互作锚点的交集分析 | HiC-Pro、hichipper、MACS2 | 将连锁不平衡候选变异限制在参与互作、且与已注释基因启动子相连的活性调控元件内 | 候选功能变异集合、候选靶基因与位点对应关系 |
| 核小体缺失区预测与候选变异进一步收敛 | HisTrader | 从 HiChIP 富集信号的低谷中预测核小体缺失区，进一步排除锚点内非开放区域的变异 | 核小体缺失区坐标、各风险位点保留下来的候选变异 |
| 细胞模型与患者样本的表观信号一致性验证 | H3K27ac ChIPmentation、Diagenode Bioruptor Pico、Diagenode IP-Star Compact、Illumina NovaSeq、deepTools | 确认细胞模型中 HisTrader 识别的核小体缺失区与胃肠癌患者肿瘤及配对参照组织中 H3K27ac 峰一致 | 患者组织 H3K27ac 富集图谱、细胞模型与患者样本的峰一致性结果 |
| 候选变异对转录因子结合的影响预测 | IGR 分析、ENCODE 转录因子 ChIP-seq 数据、FIMO 基序分析 | 预测 rs147518036 变异等位基因是否改变转录因子结合亲和力及识别基序 | 转录因子结合预测结果、GABPA 识别基序预测结果 |
| 启动子活性功能验证 | 荧光素酶报告基因、定点突变、Sanger 测序、siRNA 敲低、Tecan i2000 光谱仪 | 验证 rs147518036 参考等位基因与变异等位基因对启动子活性的影响，并确认 GABPA 的中介作用 | 荧光素酶活性比值、GABPA 敲低效率、变异等位基因依赖 GABPA 的活性变化 |
| 靶基因功能验证 | CRISPRi、dCas9-KRAB-MeCP2、慢病毒转导、sgRNA、MTS 活力检测、RT-qPCR、ddPCR、Western blot | 验证 UXS1 启动子抑制对 UXS1 表达和胃肠癌细胞活力的影响，确认 UXS1 为选择性依赖基因 | UXS1 表达水平、蛋白水平、细胞活力变化、回补实验结果 |
关键环节
风险位点候选变异的确定依赖群体遗传学数据与连锁不平衡计算。研究从 GWAS Catalog 中筛选出 68 个与胃肠癌表型在全基因组显著性水平相关的索引变异，覆盖 40 个位点，并使用 1000 Genomes 项目中欧洲和东亚人群的基因型数据，以 r2 ≥ 0.8 为标准计算索引变异周围 1 Mb 范围内的连锁不平衡变异。该环节产生的是较大范围的候选变异集合，为后续实验筛选提供输入，但不能单独区分因果变异。
H3K27ac HiChIP 是候选变异功能筛选的核心实验环节。研究在代表胃腺癌、食管腺癌和食管鳞癌的 AGS、OE33 和 KYSE140 细胞系中进行 H3K27ac HiChIP，经 MboI 酶切、生物素标记补平、连接、超声打断和 H3K27ac 抗体富集后测序。测序数据经 HiC-Pro 比对和 hichipper 识别显著染色质互作，分别在三个细胞系中获得 116398、121811 和 232301 个涉及活性调控元件的互作，其中包括大量增强子-启动子和启动子-启动子连接。将互作锚点与人群匹配的连锁不平衡变异取交集后，候选位点从 1994 个连锁不平衡变异压缩至 186 个变异、对应 281 个基因、覆盖 20 个位点。
HisTrader 预测核小体缺失区是进一步收敛候选变异的关键步骤。HiChIP 互作锚点通常跨越数千碱基，仍可能包含多个候选变异。研究利用 H3K27ac 富集信号低谷预测核小体缺失区，将候选变异限制在开放染色质区域内。以 PSCA 位点为例，仅用 HiChIP 锚点过滤后，欧洲人群和东亚人群分别剩余 22 个和 14 个候选变异；加入 HisTrader 预测的核小体缺失区后，两个人群共同剩余 8 个变异，对应 JRK 和 PSCA 两个基因。在 7 个位点，候选变异被进一步缩减为单个可能的功能变异。
患者样本 H3K27ac ChIPmentation 用于确认细胞模型预测的核小体缺失区具有疾病相关性。研究对两例胃肠癌患者的肿瘤组织和配对参照黏膜进行 H3K27ac ChIPmentation，经超声打断、抗体富集、转座酶建库和 Illumina NovaSeq 测序，并使用 deepTools 比较其与 AGS 细胞 H3K27ac HiChIP 的富集信号。结果显示，HisTrader 在共享 H3K27ac 峰内识别的核小体缺失区在细胞模型和患者组织之间保持一致，支持后续用细胞模型筛选候选变异具有参考价值。
功能验证环节用于确认 rs147518036 的调控作用及其靶基因。研究先通过 IGR 分析和 FIMO 基序分析预测 rs147518036 变异等位基因可增强 ELF1、GABPA、GABPB1 等 ETS 因子的结合，并创建更强的 GABPA 识别基序。随后用荧光素酶报告基因实验比较参考等位基因与变异等位基因的启动子活性，变异等位基因使荧光素酶表达显著升高；在 siRNA 敲低 GABPA 后，这种升高被减弱，说明该变异通过 GABPA 发挥作用。CRISPRi 抑制 UXS1 启动子后，AGS 细胞中 UXS1 表达下降超过 85%，细胞活力下降约 46%，在 MKN45 中同样观察到活力下降，而在 MKN74 中未观察到显著影响，提示 UXS1 是选择性依赖基因。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 候选变异范围收敛 | 连锁不平衡计算与 H3K27ac HiChIP | 连锁不平衡计算提供风险位点内所有可能相关的候选变异，HiChIP 通过活性调控元件注释和染色质互作信息，把候选变异限制在与已注释基因启动子有物理连接的锚点内。 |
| 分辨率提升 | H3K27ac HiChIP 与 HisTrader | HiChIP 锚点分辨率受限制片段大小限制，HisTrader 从 H3K27ac 富集信号低谷中预测核小体缺失区，将候选变异进一步限制在开放染色质区域内，在部分位点实现单个候选变异的收敛。 |
| 细胞模型与患者样本互证 | H3K27ac HiChIP 与 H3K27ac ChIPmentation | HiChIP 在细胞模型中提供高分辨率的调控元件互作和核小体缺失区预测，ChIPmentation 在患者肿瘤和配对参照组织中验证相应 H3K27ac 峰和核小体缺失区，支持细胞模型筛选结果的疾病相关性。 |
| 候选基因优先级排序 | H3K27ac HiChIP 与 DepMap CRISPR 筛选 | HiChIP 将风险变异连接到候选靶基因，DepMap 的基因依赖评分用于判断候选靶基因是否为选择性癌症依赖基因，两者结合可将变异-基因对应关系聚焦到更可能具有直接作用的位点。 |
| 变异功能预测与实验验证 | IGR 分析、基序分析与荧光素酶报告基因 | IGR 和基序分析从公共 ChIP-seq 数据预测变异对转录因子结合的影响，荧光素酶报告基因在实验层面验证变异等位基因对启动子活性的影响，并通过 siRNA 敲低确认候选转录因子的中介作用。 |
| 靶基因功能确认 | CRISPRi 与荧光素酶报告基因 | 荧光素酶报告基因确认 rs147518036 对 UXS1 启动子活性的调控，CRISPRi 抑制 UXS1 启动子后观察 UXS1 表达和细胞活力变化，并通过回补实验确认表型由 UXS1 介导。 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 从风险位点中筛选非编码功能变异 | H3K27ac HiChIP、HisTrader、连锁不平衡计算 | 在单次实验中同时获得活性调控元件注释、染色质互作和核小体缺失区信息，把风险位点内的候选变异压缩到可能的功能变异，适合非编码区关联信号的功能解释。 |
| 确认候选调控区在疾病组织中的相关性 | H3K27ac ChIPmentation、患者肿瘤与配对参照组织 | 在患者组织样本中验证细胞模型预测的 H3K27ac 峰与核小体缺失区，降低仅依赖细胞模型带来的组织相关性不足风险。前提是能够获得细胞量充足、病理评估合格的组织样本。 |
| 判断候选靶基因是否具有癌症依赖特征 | DepMap CRISPR 筛选数据、H3K27ac HiChIP 靶基因连接 | 用公共 CRISPR 筛选数据对 HiChIP 连接到的候选靶基因进行优先级排序，适合在多个候选基因中筛选更可能具有直接作用的靶点。需要注意的是，并非所有风险位点靶基因都会表现为选择性依赖。 |
| 验证变异对转录因子结合和启动子活性的影响 | IGR 分析、基序分析、荧光素酶报告基因、siRNA 敲低 | 先通过计算预测变异对转录因子结合的影响，再用报告基因实验验证等位基因特异性活性，并通过敲低候选转录因子确认中介作用，适合候选变异的功能机制研究。 |
| 验证靶基因对癌细胞表型的影响 | CRISPRi、RT-qPCR、ddPCR、Western blot、MTS 活力检测 | 通过抑制候选靶基因启动子观察表达和细胞活力变化，适合确认候选靶基因的功能相关性。前提是需要在多个细胞模型中评估，因为依赖关系可能具有细胞系特异性。 |
在类似研究中，如果研究目标是解释非编码区风险变异的功能机制，可优先考虑将 H3K27ac HiChIP 作为候选变异筛选的核心技术，配合 HisTrader 等核小体缺失区预测工具提升分辨率。患者组织 ChIPmentation 适合用于验证细胞模型预测的调控区在疾病组织中的一致性，但需要看样本质量和细胞量是否满足建库要求。DepMap CRISPR 筛选数据可用于候选靶基因的优先级排序，但依赖关系不一定适用于所有风险位点，部分位点可能通过间接机制或环境交互发挥作用。功能验证环节中，荧光素酶报告基因和 CRISPRi 分别从变异水平和基因水平提供证据，两者结合比单一实验更能形成完整证据链。需要注意的是，HiChIP 的有效性依赖抗体质量和细胞模型与目标疾病的匹配程度，不同细胞模型之间调控景观可能存在差异，更稳妥的做法是在多个相关模型中重复关键分析。
文献信息
Ansley Gnanapragasam, Eftyhios Kirbizakis, Anna Li, et al. HiChIP-Based Epigenomic Footprinting Identifies a Promoter Variant of UXS1 That Confers Genetic Susceptibility to Gastroesophageal Cancer. Cancer Research, 2024, 84(14). DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-23-2397. PMID: 38748784.