肥厚型心肌病（HCM）的分子机制尚不完全清楚，有效治疗手段有限。该研究以 Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中的三套 mRNA 转录组数据集和一套 miRNA 表达数据集为起点，通过 DEGseq、Metascape、STRING、miRWalk 和 CTD 等生物信息学工具筛选共有差异表达基因、核心基因、一致的 miRNA-mRNA 匹配以及候选药物，再利用异丙肾上腺素（ISO）诱导的 HL-1 细胞模型和 C57BL/6 小鼠模型，以实时荧光定量 PCR、免疫组化、超声心动图和 H&E 染色完成从靶点发现到药物干预的验证。
核心仪器与技术承担的作用分工明确：GEO 数据集与 R 包完成差异表达与共有基因筛选；STRING 与 miRWalk 建立蛋白互作和 miRNA-mRNA 匹配关系；CTD 数据库预测候选药物；ISO 诱导的细胞与动物模型提供体内外表型；实时荧光定量 PCR 与免疫组化检测 ATRNL1 和 WNT9A 的表达变化；超声心动图与 H&E 染色评估药物对心功能和心肌病理的改善。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 差异表达基因挖掘 | GEO 数据库、DEGseq R 包、ggplot2 R 包 | 比较 HCM 组与对照组之间的表达差异 | 火山图、上调和下调 DEGs 列表 |
| 共有与核心 DEGs 确定 | Venn 图分析 | 在三套数据集中找出共有上调和下调基因 | 8 个核心上调 DEGs、7 个核心下调 DEGs、145 个关键上调 DEGs、149 个关键下调 DEGs |
| 功能富集分析 | Metascape 在线工具、Cytoscape | 识别关键 DEGs 参与的生物学过程、通路和转录因子 | GO、KEGG、Reactome 富集结果及网络图 |
| 蛋白互作网络构建 | STRING 数据库 | 确定关键 DEGs 中的 hub 基因 | PPI 网络及 hub 基因列表 |
| miRNA-mRNA 匹配 | miRWalk 数据库、GSE197191 数据集 | 寻找与核心 DEGs 一致变化的 miRNA | hsa-miR-1469 等一致 miRNA |
| 候选药物预测 | CTD 数据库 | 筛选影响核心 DEGs 表达、丰度、甲基化或代谢的药物 | 候选药物列表及靶点数 |
| HCM 细胞模型构建 | ISO 处理 HL-1 细胞、CCK8 assay、荧光显微镜（CKX53，Olympus） | 确定 ISO 最佳浓度并确认 HCM 细胞表型 | CCK8 增殖数据、鬼笔环肽荧光染色及 IOD 值 |
| 细胞模型关键基因验证 | 实时荧光定量 PCR（CFX Connect）、Western blot | 验证核心 DEGs 在 HCM 细胞模型中的表达变化 | mRNA 相对表达量（2-ΔΔCT 法） |
| HCM 动物模型构建与药物干预 | ISO 皮下注射、腹腔注射候选药物、超声心动图 | 评估候选药物对 HCM 动物心功能的影响 | FS%、EF%、CO、SV 超声指标 |
| 心肌病理评估 | H&E 染色 | 评估心肌肥厚和纤维化程度 | 心肌细胞横截面积、组织病理形态 |
| 目标蛋白表达检测 | 免疫组化、显微镜（CX43，OLYMPUS） | 检测药物对 ATRNL1 和 WNT9A 蛋白表达的影响 | IHC 染色图像及表达定量 |
关键环节
差异表达基因挖掘环节回答 HCM 中哪些基因表达发生改变。三套 mRNA 数据集分别通过 DEGseq R 包进行组间表达比较，以 p 值 < 0.05 且 |log2(fold change)| > 1 为阈值确定 DEGs，GSE206978 得到 214 个上调、110 个下调基因，GSE180313 得到 691 个上调、378 个下调基因，GSE160997 得到 1181 个上调、493 个下调基因。火山图由 ggplot2 R 包输出，用于展示各数据集中 DEGs 的分布。Venn 分析进一步确定三套数据集共有的 8 个核心上调 DEGs（ATRNL1、BANCR、CRADD-AS1、GSG1L、MED12L、PENK、SH3GL2、WNT9A）和 7 个核心下调 DEGs（CHGB、EPHB2、HAS2、LRRN3、OSR1、SFRP5、SPOCK1），以及任意两套数据集共有的 145 个关键上调 DEGs 和 149 个关键下调 DEGs。这些列表构成后续富集、互作网络、miRNA 匹配和药物预测的输入。
富集分析和 PPI 网络环节回答这些基因参与哪些通路以及哪些基因处于网络关键位置。Metascape 以 GO、KEGG、Reactome、转录因子靶点和 DisGeNET 为来源进行通路与过程富集，关键上调基因主要富集于胶原生物合成与修饰酶、突触前膜和盐跨膜转运活性等条目，KEGG 通路包括 PI3K-Akt 信号通路；关键下调基因主要富集于细胞外基质、炎症反应和先天免疫反应等条目。Cytoscape 用于可视化富集网络。STRING 数据库以连接评分 ≥ 0.4 为标准构建 PPI 网络，上调基因网络中 COL11A1、COL11A2、COL24A1、COL9A1 和 P3H2 位于 hub 位置，下调基因网络中 C1QB、C1QC、C1QA、VSIG4 和 CD163 为重要 hub 基因。这些网络结果将单个差异基因放入相互作用背景中，为后续选择验证目标提供依据。
miRNA-mRNA 匹配环节回答哪些 miRNA 可能调控核心 DEGs。GSE197191 数据集分析得到 30 个上调 miRNA 和 6 个下调 miRNA。miRWalk 数据库以 Score = 1 匹配到 1291 个针对 8 个核心上调 mRNA 的 miRNA 和 1487 个针对 7 个核心下调 mRNA 的 miRNA。6 个下调 miRNA 与 1291 个匹配 miRNA 之间仅有一个共同 miRNA，即 hsa-miR-1469。该结果提示 miR-1469 缺乏可能是 HCM 发生的机制之一，并成为后续动物实验中 miRNA 模拟物干预的依据。
候选药物预测环节回答哪些已上市或已知化合物可能通过调控核心 DEGs 影响 HCM。CTD 数据库用于检索影响核心 DEGs 表达、丰度、甲基化或代谢过程的药物。8 个核心上调 DEGs 中，PENK 的潜在抑制剂最多（61 个），其次为 ATRNL1（31 个）、SH3GL2（29 个）和 MED12L（28 个）。排除明显毒性药物后，对乙酰氨基酚和丙硫氧嘧啶被认为是潜在 HCM 治疗药物；能增加核心下调 DEGs 表达的前列药物中，排除明确毒性药物后包括雷公藤内酯、曲古抑菌素 A 和维甲酸。这些预测结果直接进入后续动物实验的药物分组。
ISO 诱导的细胞模型环节回答核心 DEGs 在体外 HCM 表型中是否真实变化。HL-1 细胞经不同浓度 ISO 处理 24 h 后，用 CCK8 assay 确定最佳处理浓度，最终采用 10 μM ISO 处理 24 h 和 48 h 建立模型。鬼笔环肽荧光染色在荧光显微镜（CKX53，Olympus）下观察细胞骨架肌动蛋白，48 h 时鬼笔环肽染色积分光密度显著增加，确认 HCM 细胞模型建立成功。随后以实时荧光定量 PCR（CFX Connect）检测 ATRNL1、BANCR、GSG1L、MED12L、SH3GL2、WNT9A、CHGB 和 LRRN3 等尚未在 HCM 领域明确报道的基因，以 β-actin 为内参，采用 2-ΔΔCT 法计算相对表达量。结果显示，48 h 时仅 ATRNL1 和 WNT9A 显著上调，与生物信息学分析方向一致。这一环节将候选基因从纯计算列表缩小到两个可验证靶点。
动物模型和药物干预环节回答候选药物能否改善 HCM 表型以及是否影响目标蛋白表达。C57BL/6 小鼠经 ISO 皮下注射 4 周建立 HCM 模型，治疗组同时腹腔注射 miR-1469 模拟物、对乙酰氨基酚、丙硫氧嘧啶、甲吡拉敏、雷公藤内酯或维甲酸。建模结束后以超声心动图检测左心室 FS%、EF%、CO 和 SV，结果显示仅丙硫氧嘧啶在多项超声指标上表现出一致治疗作用，miR-1469 和雷公藤内酯也分别提高 CO，miR-1469 同时改善 SV。H&E 染色显示 model + miR-1469 和 model + 丙硫氧嘧啶组心肌组织异常有轻度改善。免疫组化在显微镜（CX43，OLYMPUS）下检测 ATRNL1 和 WNT9A 蛋白表达，结果显示仅丙硫氧嘧啶显著抑制 ATRNL1 表达，三种干预均抑制 WNT9A 表达。该环节将药物疗效与目标蛋白表达变化关联起来，进一步支持 ATRNL1 和 WNT9A 过表达参与 HCM 发展。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 筛选与验证 | GEO 数据集与 DEGseq R 包 → 实时荧光定量 PCR | 生物信息学筛选出的核心 DEGs 在 ISO 诱导的细胞模型中用实时荧光定量 PCR 验证，仅 ATRNL1 和 WNT9A 在 48 h 显著上调，与计算分析方向一致 |
| 网络预测与靶点选择 | STRING PPI 网络 → 免疫组化 | PPI 网络提供 hub 基因和相互作用背景，免疫组化在动物组织层面检测 ATRNL1 和 WNT9A 蛋白表达，验证其作为 HCM 相关靶点的可行性 |
| miRNA 匹配与干预 | miRWalk 数据库 → miR-1469 模拟物动物实验 | miRWalk 预测 hsa-miR-1469 与核心上调 mRNA 匹配，动物实验以 miR-1469 模拟物干预并观察超声指标和 WNT9A 表达变化 |
| 药物预测与疗效评估 | CTD 数据库 → 超声心动图、H&E 染色、免疫组化 | CTD 预测候选药物，动物模型通过超声心动图评估心功能、H&E 染色评估心肌病理、免疫组化评估目标蛋白表达，形成疗效证据链 |
| 表型确认与分子验证 | CCK8 assay、鬼笔环肽荧光染色 → 实时荧光定量 PCR | CCK8 和鬼笔环肽染色确认 HCM 细胞模型建立成功，实时荧光定量 PCR 在确认的模型上检测目标基因表达 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 从公共数据中筛选疾病相关标志物 | GEO 数据集、DEGseq R 包、ggplot2 R 包、Venn 分析 | 通过多数据集共有 DEGs 降低单数据集假阳性风险，得到较稳定的候选基因列表 |
| 对候选基因进行功能注释和网络定位 | Metascape、Cytoscape、STRING 数据库 | 将差异基因放入通路和蛋白互作背景中，识别关键 hub 基因和潜在机制方向 |
| 建立体外疾病模型并验证候选基因 | ISO 处理 HL-1 细胞、CCK8 assay、鬼笔环肽荧光染色、荧光显微镜、实时荧光定量 PCR | 在细胞层面确认疾病表型和候选基因表达变化，缩小后续动物实验的验证范围 |
| 在动物模型中评估药物疗效 | ISO 诱导 C57BL/6 小鼠、超声心动图、H&E 染色、免疫组化、显微镜 | 从心功能、组织病理和目标蛋白表达三个层面评估候选药物，形成疗效与机制的关联证据 |
| 预测并验证 miRNA 调控关系 | GSE197191 数据集、miRWalk 数据库、miR-1469 模拟物干预 | 从 miRNA-mRNA 匹配出发，在动物实验中验证 miRNA 模拟物对 HCM 表型和目标蛋白的影响 |
对实验人员来说，该组合的适用前提是具备可用的公共转录组和 miRNA 数据集，以及能建立 ISO 诱导细胞和动物模型的实验条件。如果研究目标集中在标志物发现，可优先采用多数据集共有 DEGs 加实时荧光定量 PCR 验证的组合；如果研究目标包含药物干预评估，则需要在动物模型中加入超声心动图和免疫组化，以形成从心功能到分子表达的完整证据链。需要注意的是，该文献中细胞模型仅 ATRNL1 和 WNT9A 在 48 h 显著变化，动物实验中部分药物仅在特定超声指标上达到显著，研究也未通过敲低方法验证 ATRNL1 和 WNT9A 的分子机制，因此类似研究在借鉴时应根据样品基质、模型稳定性和结果用途判断是否需要补充敲低或过表达验证。
文献信息
He H, Liao Y, Chen Y, Qin H, Hu L, Xiao S, Wang H, Yang R. Identification of ATRNL1 and WNT9A as novel key genes and drug candidates in hypertrophic cardiomyopathy: integrative bioinformatics and experimental validation. Front Mol Biosci. 2024;11:1458434. doi: 10.3389/fmolb.2024.1458434. PMID: 39329089.