自噬流是一个多步骤、受严格调控的过程，泛素化在其中参与多个环节，但具体哪些泛素化相关因子控制自噬流仍不清楚。本研究在表达 mCherry-GFP-LC3 自噬流报告系统的胰腺癌细胞 AsPC-1 中，用 CRISPR-Cas9 功能缺失文库靶向 660 个泛素化相关基因，先以 Torin1 诱导自噬，再用流式细胞术分选 GFP 与 mCherry 荧光比值升高的细胞，经过五轮分选富集后将基因组 DNA 送下一代测序，以 MAGeCK 分析基因富集。筛选将已知自噬调控因子 ATG7 等列为阳性命中，同时将 G2/M 期特异性 E3 泛素连接酶 G2E3 列为新候选。
围绕 G2E3，研究用 CRISPR-Cas9 构建敲除细胞，以蛋白免疫印迹检测 LC3B-II 与 GABARAPs 积累，用共聚焦显微镜观察 mCherry-GFP-LC3 双阳性斑点和 LC3B 与 LAMP1 共定位，再用免疫共沉淀确认 G2E3 与 GABARAP、GABARAPL1 而非 LC3B 的相互作用。多类仪器与技术形成从文库筛选到分子互作、再到表型验证的连续证据链，用于判断 G2E3 在自噬体-溶酶体融合及胰腺癌细胞迁移、侵袭中的作用。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 报告细胞系构建 | 慢病毒转导、zeocin 筛选、流式细胞术分选 | 获得稳定表达 mCherry-GFP-LC3 且对 Torin1 响应良好的 AsPC-1 报告细胞 | 双荧光细胞群体、GFP∶mCherry 比值 |
| 文库转导与筛选 | 泛素化相关蛋白 CRISPR 敲除文库、慢病毒转导、嘌呤霉素选择 | 在 660 个泛素化相关基因中引入功能缺失突变 | sgRNA 覆盖细胞库、MOI 与文库覆盖度数据 |
| 自噬流分选富集 | Torin1 诱导、流式细胞术（LSRII 检测、FACS Aria II 分选） | 富集 GFP∶mCherry 比值升高、自噬流受损的细胞 | 每轮分选 GFP 信号分布、五轮富集比例 |
| 候选基因测序分析 | 基因组 DNA 提取、PCR 扩增 sgRNA、下一代测序、MAGeCK 分析 | 比较分选组与未分选组的 sgRNA 富集差异，排序候选基因 | sgRNA 计数、RRA 评分与 p 值、候选基因排名 |
| G2E3 敲除与自噬标志物检测 | CRISPR-Cas9 敲除、qPCR、DNA 测序、SDS-PAGE 与免疫印迹 | 确认 G2E3 敲除并检测 LC3B-II、GABARAP、GABARAPL1 水平变化 | 敲除克隆序列、mRNA 水平、自噬标志物蛋白条带 |
| 自噬流与融合定位观察 | mCherry-GFP-LC3 报告、共聚焦激光显微镜、免疫荧光染色 | 判断自噬体是否正常与溶酶体融合，评估 LC3B 与 LAMP1 共定位 | 双阳性与 mCherry 单阳性斑点计数、Pearson 共定位系数 |
| 分子互作验证 | G2E3-FLAG 转染、免疫共沉淀、SDS-PAGE 与免疫印迹 | 确定 G2E3 与 ATG8 家族成员的结合特异性 | 免疫沉淀复合物中 GABARAP、GABARAPL1、LC3B 信号 |
| 肿瘤细胞表型分析 | 流式细胞术凋亡检测、克隆形成、划痕愈合、Transwell 迁移与侵袭、蛋白免疫印迹 | 评估 G2E3 敲除对胰腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 | 凋亡比例、克隆数、迁移率、迁移与侵袭细胞数、p53R2 与 RAS-G12D 表达 |
关键环节
报告细胞系是后续所有分选与成像的基础。mCherry-GFP-LC3 报告系统利用 GFP 对酸性环境敏感、mCherry 相对稳定的特性：自噬体与溶酶体融合后，溶酶体酸性 pH 淬灭 GFP 荧光，而 mCherry 信号保留，因此通过 GFP∶mCherry 比值变化可定量反映自噬流状态。研究先用流式细胞术分选稳定表达报告系统的细胞，并以 Torin1 与氯喹处理验证报告系统的响应性。共聚焦成像显示，Torin1 处理使野生型细胞出现 mCherry 单阳性斑点，提示自噬溶酶体形成；氯喹处理则使双阳性斑点增加，提示融合受阻。这一环节为文库筛选提供了可量化的自噬流读出。
文库筛选环节回答的是「哪些泛素化相关基因参与自噬流调控」。研究使用含 11108 条 sgRNA、靶向 660 个泛素化相关蛋白（E1、E2、E3 连接酶和去泛素化酶）的混合文库，并设置 1000 条非靶向 sgRNA。转导后以 Torin1 诱导自噬，用流式细胞术收集 GFP∶mCherry 比值升高幅度靠前的 3% 细胞，再连续扩增并分选四轮，使高 GFP∶mCherry 比值细胞从 3% 富集至约 90%。基因组 DNA 经 PCR 扩增 sgRNA 片段后行下一代测序，MAGeCK 分析显示 ATG7、FBXO2、TBC1D25、UCHL1、USP18 等已知自噬调控因子进入前十，验证了筛选方法的可靠性；G2E3 作为新命中获得高评分，成为后续功能研究的切入点。
G2E3 敲除与自噬标志物检测环节回答的是「G2E3 缺失是否改变自噬流」。研究在 AsPC-1、A549 和 HEK293TN 细胞中用 CRISPR-Cas9 构建 G2E3 敲除细胞，以 qPCR 和 DNA 测序确认敲除效果，并观察到 AsPC-1 与 A549 敲除细胞中 LC3B-II、GABARAP 和 GABARAPL1 水平升高，HEK293TN 敲除细胞中 GABARAP 与 GABARAPL1 升高而 LC3B 无明显变化。与 ATG7 敲除导致 LC3B-I、GABARAPL1-I 和 P62 升高、LC3B-II 与 GABARAPL1-II 降低的模式不同，G2E3 敲除表现为 LC3B-II 积累，提示自噬流受损而非自噬体形成受阻。蛋白免疫印迹在此承担的是区分自噬体形成与降解受阻的关键证据。
自噬流与融合定位观察环节回答的是「G2E3 缺失是否影响自噬体与溶酶体融合」。共聚焦显微镜显示，Torin1 诱导后野生型 AsPC-1 报告细胞以 mCherry 单阳性斑点为主，而 G2E3 敲除细胞中多数自噬体维持 mCherry-GFP 双阳性，双阳性斑点数量增加、mCherry 单阳性斑点减少。免疫荧光染色进一步显示，G2E3 敲除细胞中 LC3B 与 LAMP1 阳性溶酶体的共定位显著减少，Pearson 共定位系数降低。该环节把自噬流报告系统的荧光表型定位到自噬体-溶酶体融合步骤，为「G2E3 参与晚期自噬」提供了形态学证据。
分子互作验证环节回答的是「G2E3 通过什么分子实现调控」。免疫共沉淀显示，瞬时表达的 G2E3-FLAG 与内源性 GABARAP 和 GABARAPL1 结合，而不与 LC3B 结合，在 AsPC-1 细胞中得到验证。共聚焦成像也显示 G2E3-FLAG 与 GABARAP、GABARAPL1 的共定位强于与 LC3B 的共定位，并与 LAMP1 共定位。该环节将筛选得到的候选基因连接到 ATG8 家族成员的特异性相互作用，支持 G2E3 通过 GABARAPs 依赖机制促进自噬体-溶酶体融合。
肿瘤细胞表型分析环节回答的是「G2E3 缺失是否影响胰腺癌细胞进展」。流式细胞术凋亡检测和克隆形成实验显示 G2E3 敲除对 AsPC-1 细胞凋亡和克隆潜能无明显影响；划痕愈合实验显示迁移能力下降约 50%，Transwell 迁移下降约 41%，侵袭下降约 80%。蛋白免疫印迹显示 G2E3 敲除细胞中 p53R2 表达上调，而 RAS-G12D 无明显变化，EMT 相关标志物 N-cadherin、E-cadherin 和 Vimentin 也无显著差异。Kaplan-Meier 生存分析提示 G2E3 低表达与胰腺癌患者更长生存相关。该环节将自噬调控与肿瘤细胞迁移、侵袭表型联系起来。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 筛选与读出互补 | CRISPR-Cas9 泛素化文库、mCherry-GFP-LC3 报告系统、流式细胞术 | 文库提供基因扰动，报告系统提供自噬流荧光读出，流式分选把自噬流受损细胞从混合群体中富集出来 |
| 筛选与测序衔接 | 流式分选、基因组 DNA 提取、下一代测序、MAGeCK 分析 | 分选后的细胞群体经测序获得 sgRNA 丰度，MAGeCK 通过比较分选组与对照组富集差异排出候选基因 |
| 蛋白水平验证 | CRISPR-Cas9 敲除、qPCR、SDS-PAGE 与免疫印迹 | 敲除验证确认基因缺失，免疫印迹检测 LC3B-II 与 GABARAPs 积累，区分自噬体形成与降解受阻 |
| 形态学与分子互作互证 | 共聚焦激光显微镜、免疫荧光、免疫共沉淀 | 共定位显示 G2E3 与 GABARAPs 及溶酶体的空间关系，免疫共沉淀确认蛋白间直接结合并排除 LC3B |
| 表型与临床关联 | 划痕愈合、Transwell、流式凋亡检测、Kaplan-Meier 分析 | 体外迁移侵袭表型与患者生存数据共同提示 G2E3 与胰腺癌进展相关 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 从泛素化相关基因中筛选自噬流调控因子 | CRISPR-Cas9 混合文库 + mCherry-GFP-LC3 报告系统 + 流式细胞分选 + 下一代测序 | 把基因扰动、自噬流荧光读出和高通量分选整合，适合在特定细胞背景中寻找新的自噬调控候选 |
| 确认候选基因对自噬流的影响 | CRISPR-Cas9 敲除 + 蛋白免疫印迹 + 共聚焦显微镜 | 蛋白水平区分自噬体形成与降解受阻，共聚焦成像把表型定位到自噬体-溶酶体融合步骤 |
| 解析候选蛋白的分子互作特异性 | 免疫共沉淀 + 免疫荧光共定位 + SDS-PAGE 与免疫印迹 | 确认候选蛋白与 ATG8 家族成员或其他自噬相关蛋白的结合关系，支持机制推断 |
| 评估候选基因对肿瘤细胞表型的影响 | 划痕愈合 + Transwell 迁移与侵袭 + 流式凋亡检测 + 克隆形成 | 从增殖、凋亡、迁移和侵袭多个维度评估候选基因的功能后果 |
对实验人员来说，这套组合的适用前提是：细胞系能够稳定表达 mCherry-GFP-LC3 报告系统，且对自噬诱导剂有可检测的荧光比值响应；文库转导需要达到足够的 sgRNA 覆盖度，避免因细胞数量不足导致候选丢失。需要注意的是，荧光报告系统反映的是群体水平的自噬流状态，分选窗口和轮次会直接影响候选基因的富集；免疫共沉淀和共定位只能说明蛋白结合与空间邻近，是否直接催化底物泛素化还需要看后续实验设计。更稳妥的理解是，该文献把 CRISPR 筛选用于候选发现，把蛋白与成像技术用于机制和表型验证，而不是依赖单一仪器得出完整结论。
文献信息
Gong Y, Leon M, Mo H, et al. CRISPR-Cas9 screening reveals G2E3 as a novel ubiquitin-linked factor controlling autophagosome-lysosome fusion and cancer cell progression. Cell Death Discov. 2025. PMID: 41068090. DOI: 10.1038/s41420-025-02717-0.