主动脉瓣狭窄多族群 GWAS 与 TWAS 筛选治疗靶点：从风险位点到 siRNA 功能验证的仪器技术链

主动脉瓣狭窄（AS）迄今缺乏药物干预手段。本研究在 2,853,408 名个体（含 86,864 例 AS）中开展多族群 GWAS 荟萃分析，发现 241 个常染色体独立风险位点和 3 个 X 染色体风险位点，并按性别与遗传 ancestry 分层识别额外位点。在此基础上，研究以人类主动脉瓣（AV）表达定量性状位点（eQTL）进行 TWAS，发现 54 个新基因；随后用基因功能注释方法为每个 lead variant 优先排序候选因果基因，并构建新的 AS 多基因风险评分（PRS）。在功能层面，研究对人瓣膜间质细胞（VIC）进行 siRNA 基因沉默，以茜素红染色定量矿化，发现沉默 CMKLR1 与 LTBP4 可显著降低矿化，并通过免疫荧光在人类 AV 组织中验证两者的钙化定位。

从仪器与技术角度看，这条证据链由多个环节串联：多样本基因分型与插补支撑 GWAS；RNA 测序与基因分型共同生成 AV 特异性 eQTL 模型；TWAS 与共定位将遗传关联映射到基因；cS2G、PolyPhen-2/SIFT 等注释工具完成 SNP 到基因的优先级排序；PRS 在独立队列中用 Cox 模型与 C-index 评估预测性能；最后以 siRNA 转染、RT-qPCR 和茜素红染色在体外闭合功能验证。

实验流程

关键环节

GWAS 荟萃分析环节回答的核心问题是：在跨族群、大样本条件下，哪些基因组区域与 AS 风险稳健关联。研究将 30 项研究的汇总数据上传至 Broad Institute 与加拿大数字研究联盟的中央服务器，由两名作者独立完成 consortium 层面质控，剔除插补质量 ≤0.3 或最小等位基因计数 <10 的变异，并用 LiftOver v1.04.00 将 hg19 坐标转换为 hg38。LD score 回归用于校正膨胀，固定效应逆方差加权荟萃分析由 GWAMA v2.2.2 完成。该环节产生的 lead variants 及其效应量、等位基因频率是后续所有基因优先级排序、共定位和 PRS 构建的输入。

TWAS 环节回答的问题是：哪些基因通过 AV 组织中的差异表达影响 AS 风险。研究使用 484 名接受 AV 置换或心脏移植个体的 AV 样本，在 Illumina NovaSeq 6000 上完成 RNA 测序，目标为每样本 >5000 万对 reads，并以 GENCODE Release 41、GRCh38 构建进行 read 计数；基因分型在 Illumina Global Screening Array 上完成，经 TOPMed 插补参考面板插补基因型。PredictDB v7 以嵌套交叉验证训练弹性网模型，估计 SNP 对蛋白编码基因表达的调控效应，模型显著性阈值为预测表达与观测表达的 Pearson 相关 >0.1 且 P < 0.05。TWAS 在 MetaXcan v0.7.4 的 S-PrediXcan 扩展中执行，显著性阈值经 Bonferroni 校正为 P < 4.73 × 10⁻⁶。COLOC v3.2.1 用于评估 AV eQTL 与 AS 风险的共定位，以 PP4 > 0.75 作为共享信号证据。该环节产生的 66 个共定位基因构成后续功能验证的候选池。

候选因果基因优先级排序环节回答的问题是：261 个 lead variants 各自最可能通过哪个基因发挥作用。研究整合了最近基因、cS2G 注释（cS2G 分数 ≥0.5）、瓣外 eQTL 共定位、蛋白改变变异、AV eQTL TWAS 与共定位、AV 基因表达或蛋白丰度数据共六类方法。对与破坏性蛋白编码变异显著 LD（r² > 0.8）的 lead variant，直接优先该变异所在基因；其余按支持方法数量共识确定，方法数相同时取最近基因。PolyPhen-2 与 SIFT 用于对错义变异进行致病性预测。90/261（34%）的基因获 3 种以上方法支持，127/261（47%）的基因在 AV 中有转录或蛋白产物证据。该优先级排序结果是选择 CERS2、CEP120、LTBP4、CMKLR1、CLCA2 五个基因进入功能实验的直接依据。

PRS 构建与评估环节回答的问题是：大样本 GWAS 能否转化为具有临床预测价值的遗传风险评分。研究以排除 MGBB 和 UKB 的常染色体 GWAS 汇总数据为输入，分别用 LDpred2 与 PRS-CS 生成评分，在 MGBB 中选出表现最佳者，再在 UKB、UCLA ATLAS 和六项 TIMI 临床试验汇总数据中验证。Cox 比例风险模型用于计算调整年龄、性别、前五个主成分及临床风险因素后的 HR，C-index 与连续 NRI 用于评估预测增益。最佳评分采用 LDpred2，因果 SNP 比例设为 0.056，遗传力为 1.4 倍估计值，并启用稀疏性。该环节产生的预测性能数据支持「新 PRS 优于既往已发表评分」这一结论。

功能验证环节回答的问题是：GWAS 与 TWAS 优先排序的基因是否对瓣膜矿化具有直接作用。研究从 11 名接受 AV 置换手术的严重 AS 患者获取 AV 样本，经胶原酶消化分离原代 VIC，取第 4～7 代用于实验。VIC 以 1 × 10⁵ cells ml⁻¹ 接种于 24 孔或 48 孔板，24 h 后用 DharmaFECT 1 转染试剂递送 20 nmol l⁻¹ siRNA，靶向 LTBP4、CMKLR1、CLCA2、CERS2 或 CEP120，并用对照 siRNA 平行处理。3 天后换为正常培养基或成骨培养基，该时间点记为第 0 天，此后每 3～4 天换液并重复转染。基因沉默效率经 RT-qPCR 在 QuantStudio 5 实时 PCR 系统上确认，以 GAPDH 为内参。矿化以 2% 茜素红染色检测，染色经 5% 甲酸提取后在 450 nm 测定吸光度。siRNA 转染使五个基因表达下降 57%（LTBP4）至 80%（CLCA2）；CMKLR1 沉默使染色强度平均差为 −0.19（P = 0.028），LTBP4 沉默平均差为 −0.31（P = 0.049），CLCA2、CERS2、CEP120 沉默未显著抑制矿化。

组织学验证环节回答的问题是：体外沉默实验涉及的基因在人类 AV 组织中是否与钙化区域空间相关。研究对 3 名供体的 AV 样本进行 OCT 包埋，用 Leica CM3050S 冷冻切片机切 7 µm 连续切片，经 4% 多聚甲醛固定、阻断液孵育后，与 anti-LTBP4 和 anti-CMKLR1 一抗 4 ℃ 孵育过夜，再用 Alexa Fluor 594 标记的二抗、OsteoSense680 钙化近红外荧光探针和含 DAPI 封片剂处理后，用 Nikon Eclipse 共聚焦显微镜采集信号。结果显示 LTBP4 定位于钙化结节和肌样细胞，CMKLR1 与 OsteoSense680 阳性钙化瓣膜细胞及 AV 微血管共定位。该数据补充了 CMKLR1 与 LTBP4 在人类钙化 AV 中高表达的空间证据。

技术协同

研究组合

在类似研究中，若研究目标是优先排序候选因果基因，TWAS 与共定位的组合通常比单独的 TWAS 更稳妥，因为共定位可降低由 LD 引起的假关联。若研究目标是验证基因功能，siRNA 沉默配合矿化染色和 RT-qPCR 是较直接的路径，但需注意沉默效率、供体间差异和培养基条件对表型的影响。本研究的功能验证基于 11 名供体的原代 VIC，矿化检测以茜素红染色吸光度为读出，未涉及基因过表达或动物模型，因此对 CMKLR1 与 LTBP4 作用的解读应限于该体外体系。PRS 的预测性能在 UKB 与 TIMI 试验中不同，研究将其部分归因于 UKB 人群更年轻、更健康，这提示跨队列验证时需考虑人群特征差异。本研究 GWAS 以欧洲 ancestry 为主，非欧洲人群样本量有限，PRS 在非欧洲人群中的关联强度较低，其可迁移性需要更多样本验证。

文献信息

Small AM, Yang TY, Itoh S, et al. Genomic and transcriptomic analyses of aortic stenosis enhance therapeutic target discovery and disease prediction. Nature Genetics. 2025. PMID: 41419686. DOI: 10.1038/s41588-025-02417-6.