晚期黑色素瘤接受免疫检查点抑制剂（ICI）治疗时，临床亟需能在治疗前和治疗过程中动态反映肿瘤负荷与耐药出现的标志物。肿瘤组织信息型（tumor-informed）ctDNA 方法灵敏度高，但依赖原发或转移灶组织的测序结果；肿瘤未知（tumor-agnostic）方法虽可脱离组织，却常因基因组覆盖范围有限而在肿瘤演化后出现漏检。该研究采用覆盖 BRAF、NRAS、KRAS、EGFR、PIK3CA 共 1114 个 COSMIC 突变的 SYSMEX 靶向 NGS panel（Plasma-SeqSensei），对 39 例不可切除 III/IV 期黑色素瘤患者的 241 份纵向血浆样本进行 ctDNA 检测，并与配对的肿瘤组织 NGS、S100、LDH 等实验室指标及影像学疗效评估进行关联分析。检测灵敏度达到 7 个突变分子，对应 0.07% 突变等位基因频率（MAF）。
研究结果显示，基线 ctDNA 阳性率为 64.5%，治疗期间任意时间点阳性率为 82.05%；组织与血浆总体一致性为 51.6%，且活检与血浆采样间隔越长越容易出现不一致（p = 0.0105）。治疗期间持续或重新出现的 ctDNA 阳性与更短的无进展生存期（PFS）相关（p = 0.003），早期 NRAS 和 KRAS ctDNA 水平升高与不良疗效相关（p = 0.0069 和 p = 0.028），即使低水平 ctDNA 持续存在（5～10 MM/mL）也提示不良预后（p = 0.0054）。这些数据支持将肿瘤未知广谱 NGS ctDNA 检测用于 ICI 治疗过程中的实时分子监测。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 血浆采集与 cfDNA 提取 | 两次离心（300 × g、1800 × g）、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit、Qubit 4 Fluorometer | 从外周血中稳定获得足量 cfDNA 用于下游建库 | cfDNA 浓度与体积数据，用于确定每个时间点的建库投入量 |
| cfDNA 文库构建与靶向富集 | Plasma-SeqSensei SOLID CANCER RUO/IVD kit（基于扩增子的富集策略，引入 UMI） | 在碎片化 cfDNA 上高灵敏、低背景地富集 5 个基因的 1114 个 COSMIC 突变位点 | 带分子标签的靶向文库，每份样本投入 7.6～56.6 ng cfDNA |
| 文库质控与测序 | Bioanalyzer、NextSeq 550 测序仪 | 确认文库质量并完成高通量测序 | 原始测序读段（reads），进入 SafeSEQ 分析流程 |
| 变异识别与过滤 | SafeSEQ 分析流程（UMI 家族分组、一致性序列构建、变异 calling） | 区分真实体细胞突变与 PCR/测序伪影，控制假阳性 | 突变分子数（MM/mL）、突变等位基因频率（MAF）、CDS 与氨基酸改变 |
| 组织对照 NGS 分析 | QIAseq Targeted DNA Panel、定制 Qiagen panel、AmpliSeq Focus Panel、Illumina 平台 | 获取配对肿瘤组织的突变谱，用于组织-血浆一致性分析 | 组织 VAF ≥ 5%、深度 ≥ 500 × 的体细胞突变列表 |
| 其他血液标志物检测 | ADVIA 2120i、Atellica Solution CH930、Liaison XL 等常规检验平台 | 获取与 ctDNA 平行比较的临床实验室参数 | LDH、S100B、D-二聚体、CRP、白细胞及亚群计数 |
| 疗效评估与生存分析 | 脑 MRI、胸腹盆 CT、RECIST 1.1、Kaplan-Meier 与 log-rank 检验 | 将 ctDNA 动态与影像学最佳总体缓解及 PFS/OS 关联 | 最佳总体缓解（CR/PR/SD/PD）、PFS、OS 及组间差异 p 值 |
关键环节
血浆 cfDNA 的提取与定量是整条证据链的起点。研究采用两次离心去除细胞碎片，使用 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 提取 cfDNA，并以 Qubit 4 Fluorometer 配合 dsDNA HS 试剂定量。每份样本每个时间点的建库投入量在 7.6～56.6 ng 之间，根据 cfDNA 可得量逐一确定。该环节决定了后续 NGS 能否获得足够的可分析分子数，对低丰度 ctDNA 样本而言，投入量不足会直接影响检出概率。
靶向文库构建与测序环节承担了肿瘤未知策略的核心功能。Plasma-SeqSensei SOLID CANCER kit 采用基于扩增子的富集策略，并针对碎片化 cfDNA 进行优化；每个 cfDNA 分子在扩增前引入唯一分子标识符（UMI），以便后续进行错误校正。文库经 Bioanalyzer 定量后在 NextSeq 550 上测序。该设计使 panel 无需预先获得患者肿瘤组织即可覆盖 BRAF、NRAS、KRAS、EGFR、PIK3CA 五个基因的 1114 个 COSMIC 突变，同时将报告阈值设定为 ≥ 7 个突变分子，对应 0.07% MAF。分析性能按 CLSI 指南（EP17-A2、EP05-A3、EP06-A、EP07-A2）验证，LoD95 为 6.21 个突变分子（95% CI：5.47～7.26），并通过 in-silico BLAST 和健康供者 cfDNA 建立的位置特异性空白限（LoB）控制背景噪声。
SafeSEQ 分析流程将带相同 UMI 的读段分组、构建一致性序列，再与参考基因组比对并仅报告高于 LoD 且超出 LoB 的变异。对实验人员来说，这一环节是区分真实体细胞突变与背景伪影的关键；没有 UMI 校正和 LoB 过滤，低至 5～10 MM/mL 的 ctDNA 水平变化很难被可靠识别，而该研究恰恰显示这一区间的 ctDNA 持续存在具有预后意义（p = 0.0054）。
组织对照 NGS 环节用于评估血浆与组织的突变一致性。按样本可得性和分析时间，研究分别使用了 QIAseq Targeted DNA Panel、定制 Qiagen panel 或 AmpliSeq Focus Panel，并在 Illumina 平台上测序；生物信息学流程以 GRCh37/hg19 为参考，过滤标准为最低读深 500 ×、VAF ≥ 5%，并按 ACMG/AMP 指南人工审核临床相关变异。组织与血浆总体一致性为 51.6%，不一致组活检与血浆采样平均间隔 448 天（SD ± 135.9 天），一致组平均间隔 73 天（SD ± 56.03 天），差异显著（p = 0.0105）。12.2% 的病例表现为部分一致，即在共享突变之外还检出仅存在于血浆的额外变异，提示血液分析可补充组织活检未捕获的亚克隆或新出现变异。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | Qubit 4 Fluorometer → Plasma-SeqSensei 建库 → Bioanalyzer → NextSeq 550 | cfDNA 定量结果决定建库投入量，文库质控结果决定上机测序，构成从样本到原始读段的连续流程 |
| 分析互补 | UMI 标记与 SafeSEQ 分析流程 | UMI 在分子层面提供错误校正能力，SafeSEQ 在数据分析层面完成一致性构建与变异过滤，两者共同支撑 0.07% MAF 的报告阈值 |
| 相互验证 | 血浆靶向 NGS 与组织靶向 NGS | 组织突变谱作为血浆结果的对照，一致性 51.6% 及 12.2% 部分一致病例揭示两种样本类型的互补关系与采样时间间隔的影响 |
| 平行关联 | ctDNA NGS 与常规血液标志物检测平台 | S100、LDH 等常规指标与 ctDNA 在同一队列中平行检测，ctDNA 阳性与 S100 升高相关（p = 0.047），提示可联合解读 |
| 临床锚定 | ctDNA 动态监测与影像学评估 | 纵向 ctDNA 结果与 RECIST 1.1 评估的缓解状态及 PFS/OS 关联，使分子层面的动态变化获得临床终点支持 |
该研究的证据链并非依赖单一仪器，而是由样本前处理、靶向富集、UMI 校正测序、组织对照和临床随访共同构成。对实验人员而言，更稳妥的理解是：ctDNA 检测的可靠性取决于每个环节的衔接，其中 cfDNA 投入量、UMI 校正效率和 LoB 设定会直接影响低丰度突变能否被稳定报告，而组织对照的采样时间间隔则是解读组织-血浆一致性时不可忽略的变量。
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 肿瘤组织不可及或组织量不足时进行体细胞突变检测 | 血浆 cfDNA 提取（QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit）+ 肿瘤未知靶向 NGS panel + UMI 校正分析流程 | 无需预先获得肿瘤组织即可覆盖多基因多位点，适合原发灶已切除或转移灶活检困难的情形 |
| ICI 治疗过程中的动态分子监测 | 纵向血浆采样 + 高灵敏 ctDNA NGS + 影像学评估 + 生存分析 | 可捕捉治疗期间的 ctDNA 清除、持续或重新出现模式，并与 PFS 等终点关联 |
| 评估血浆与组织突变谱的差异 | 血浆靶向 NGS + 配对肿瘤组织靶向 NGS | 通过一致性分析识别组织未覆盖的亚克隆变异，但需注意两次采样时间间隔对结果的影响 |
| ctDNA 与常规血液标志物的联合解读 | ctDNA NGS + 常规检验平台（S100、LDH、CRP 等） | 在分子层面之外提供肿瘤负荷与炎症状态的补充信息，便于综合判断 |
上述组合的适用前提是样本类型为血浆 cfDNA，且研究目标为体细胞突变的定性和定量检测；其边界在于该 panel 仅覆盖 5 个基因的预设位点，未纳入 TERT、NF1 等新兴黑色素瘤驱动基因，可能影响部分患者的检出与分层。此外，脑转移灶的 ctDNA 释放量可能偏低，该研究中两例转为 ctDNA 阴性的患者仍因脑转移快速进展，提示血浆 ctDNA 阴性不能直接排除中枢神经系统病灶的存在。如果研究目标是提高组织-血浆一致性解读的可靠性，更适合的做法是尽量缩短组织活检与血浆采样之间的时间间隔，并结合影像学结果综合判断。
文献信息
Heidrich I, Rautmann C, Ly C, et al. In-depth assessment of BRAF, NRAS, KRAS, EGFR, and PIK3CA mutations on cell-free DNA in the blood of melanoma patients receiving immune checkpoint inhibition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2025;31:1-18. doi:10.1186/s13046-025-03457-w. PMID: 40652269.