镰状细胞病由 HBB 基因错义突变引起，当前药物疗效有限，异基因造血干细胞移植受供者与免疫毒性限制。通过编辑自体造血干细胞重新激活胎儿血红蛋白（HbF），是潜在的治愈路径。本研究围绕 γ-珠蛋白启动子上的 BCL11A 与 ZBTB7A 抑制因子结合基序展开，比较不同靶点的 HbF 诱导能力，并在镰状细胞病患者来源的动员 CD34+ 造血干祖细胞中验证编辑效率、HbF 水平与镰状化改善，随后完成 GMP 级 Cas9、sgRNA 与细胞药物产品的工艺表征及全基因组安全性评估。
研究中，电转系统承担 Cas9 核糖核蛋白复合物的胞内递送，NBSGW 小鼠移植用于评估骨髓再殖造血干细胞的实际编辑效率与红细胞谱系 HbF 诱导，离子交换高效液相色谱（IE-HPLC）定量血红蛋白四聚体，单细胞蛋白质印迹与单细胞 RNA 测序解析 HbF 诱导的细胞异质性，CHANGE-seq、靶向扩增子测序、ddPCR、PacBio 长读长测序与 UDiTaS 则构成脱靶与结构变异的安全评价层。整体证据链以体内药效数据作为靶点选择的判据，以多层级基因组学数据支撑安全性结论。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 靶点比较与先导靶点筛选 | Lonza 4D Nucleofector 电转；IE-HPLC；NBSGW 小鼠移植 | 比较 −196 ZBTB7A 与 −115 BCL11A 基序编辑后 HbF 诱导能力 | 插入缺失频率、HbF 百分比、体内再殖编辑频率 |
| 患者来源细胞药效验证 | MaxCyte GTx 电转；NBSGW 小鼠移植；IE-HPLC；流式细胞术 | 在镰状细胞病供者 CD34+ 细胞中验证编辑与 HbF 诱导 | 植入率、多谱系分化、插入缺失频率、HbF 百分比 |
| 体外镰状化功能评价 | SH800 分选；IncuCyte S3 活细胞成像 | 评估 HbF 诱导是否降低低氧诱导的镰状化 | 镰状化网织红细胞百分比 |
| HbF 诱导广度分析 | 流式细胞术；单细胞蛋白质印迹；单细胞 RNA 测序 | 判断 HbF 是否在全细胞群广泛诱导及转录异质性 | F 细胞比例、单细胞 γ-珠蛋白信号、HBG 转录本分布、UMAP 聚类 |
| GMP 级试剂与工艺表征 | 5 L 发酵罐；SP 柱、CHT 柱；体积排阻色谱；SMARTer smRNA-seq | 制备临床级 Cas9 与 sgRNA，优化 RNP 复合与电转条件 | 蛋白质纯度、宿主蛋白与内毒素残留、游离 sgRNA 比例、编辑效率 |
| 脱靶与结构变异评估 | CHANGE-seq、rhAmp-seq、ddPCR、PacBio 长读长测序、UDiTaS、G 带核型分析 | 检测小插入缺失、4.9 kb 缺失、易位与其他重排 | 候选脱靶位点、插入缺失频率、4.9 kb 缺失频率、结构变异图谱 |
关键环节
先导靶点选择直接决定后续疗效评价的走向。研究以电转方式将靶向 −196 或 −115 位点的 Cas9 核糖核蛋白复合物导入正常供者动员 CD34+ 细胞，四天后用高通量测序测定插入缺失频率。野生型与高保真 Cas9 在输入细胞中均可获得约 76%～86% 的编辑效率。但体外红系分化后的 IE-HPLC 显示，−115 位点编辑的 HbF 诱导高于 −196 位点。更关键的是，研究将编辑细胞移植入 NBSGW 小鼠，17 周后从骨髓回收人源细胞，再以 IE-HPLC 测定 CD235a+ 红系后代的 HbF。此时 −115 位点的优势显著放大，而高保真 Cas9 在再殖造血干细胞中的编辑频率明显下降，HbF 诱导相应降低。这一对比说明，体外编辑效率与 HbF 水平不足以预测体内药效，需要以移植后数据作为靶点和编辑酶选择的依据。
患者来源细胞的药效验证沿用同一路径。研究电转三例镰状细胞病供者（两例 HbSS、一例 HbSC）与一例正常供者的动员 CD34+ 细胞，移植后 17 周评估。靶向测序显示输入细胞编辑频率稳定在约 86%，再殖人源细胞中仍保留约 73%，骨髓红系后代 HbF 达约 30.6%，而对照组低于 2%。流式细胞术同时确认编辑未改变人源细胞植入率及 T 细胞、B 细胞、髓系和红系的分化比例。这一环节将编辑效率、HbF 诱导与造血重建能力放在同一实验框架内，说明该编辑策略未显著损害造血干细胞功能。
HbF 诱导是否具有治疗意义，需要功能层面的读数。研究将编辑后的 CD34+ 细胞体外分化为红系，分选去核细胞后在 2% 氧气条件下孵育 8 h，用 IncuCyte S3 活细胞成像系统采集图像，由盲法观察者计数镰状化细胞。HbSS 供者来源的未编辑对照组镰状化比例约 66.9%，编辑后降至约 23.8%；HbSC 供者来源细胞从约 12.9% 降至约 1.3%。IE-HPLC 给出的 HbF 水平与镰状化下降相互印证，构成从分子表型到细胞功能表型的药效证据。
HbF 的广度和均一性决定其抑制 HbS 聚合的实际效果。研究采用流式细胞术、单细胞蛋白质印迹与单细胞 RNA 测序三种互补方法分析移植后骨髓来源的 CD235a+ 细胞。流式检测显示 F 细胞比例从约 29.8% 升至约 74.4%；单细胞蛋白质印迹经聚丙烯酰胺凝胶芯片裂解、电泳并由 InnoScan710 芯片扫描仪读取，显示编辑后 γ-珠蛋白阳性细胞比例从约 1.2%～6.1% 升至约 49.3%～58.2%；单细胞 RNA 测序显示编辑后约 88.2% 的红系细胞 γ-珠蛋白转录本占 β 类珠蛋白转录本比例超过 30%，且 HBG 表达呈双峰分布并向高水平偏移，UMAP 聚类未显示编辑改变红系成熟阶段比例。三种方法灵敏度与动态范围不同，结论方向一致，支持 HbF 在多数红细胞中广泛诱导。
技术协同
本研究的仪器与技术组合形成层次分明的证据链，不同层级之间是互补与验证关系，而非简单替代。
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 递送与定量互补 | Lonza 4D Nucleofector、MaxCyte GTx、高通量测序 | 电转完成 RNP 递送，测序定量插入缺失频率，二者共同定义编辑效率 |
| 体外与体内验证 | 体外红系分化培养、NBSGW 小鼠移植、IE-HPLC | 体外分化反映短期编辑结果，移植后骨髓红系后代 HbF 反映再殖造血干细胞的真实药效 |
| 蛋白与转录本互证 | 流式细胞术、单细胞蛋白质印迹、单细胞 RNA 测序 | 分别从完整细胞、单细胞蛋白和单细胞转录本层面判断 HbF 诱导广度与异质性 |
| 功能与表型印证 | IE-HPLC、IncuCyte S3 活细胞成像 | HbF 定量结果与低氧镰状化下降在功能层面相互支持 |
| 发现与确认分层 | CHANGE-seq、rhAmp-seq、ddPCR、PacBio、UDiTaS | CHANGE-seq 无偏发现候选脱靶位点，靶向测序与结构变异方法确认编辑安全性 |
安全性评价部分以 CHANGE-seq 为起点。该生化方法通过体外切割并选择性测序，在三个正常供者基因组 DNA 中识别出 678 个候选脱靶位点，其中重复出现的 277 个位点与计算工具预测位点合并后，用 rhAmp-seq 多重靶向扩增子测序检测。结果显示靶向编辑频率约 91.5%，在 325 个可扩增位点中未检出脱靶插入缺失。针对 HBG1 与 HBG2 串联基因同时切割可能产生的 4.9 kb 缺失，研究用 ddPCR 定量，在临床规模编辑的 CD34+ 细胞中约为 29.8%，移植后骨髓细胞中为 12.8%～29.7%；PacBio 长读长测序未发现该区域其他非预期大片段缺失。UDiTaS 定向测序在编辑后第 5 天和第 14 天未检出可重复的易位或结构重排，G 带核型分析未发现异常。单细胞 RNA 测序结合 inferCNV 分析也未提示染色体水平拷贝数异常。多方法相互补充，但各自存在检测偏好，例如长读长 PCR 对较短片段扩增效率更高，可能高估 4.9 kb 缺失比例，因此结论需结合方法学边界理解。
研究组合
将本研究的仪器组合转译为可借鉴方案时，需要先明确研究目标与样品条件。以下组合对应不同评价阶段，适合在具备相应细胞制备与动物实验条件的研究中使用。
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 候选靶点或编辑酶比较 | 电转系统＋高通量测序＋IE-HPLC＋NBSGW 小鼠移植 | 以体内再殖细胞的 HbF 诱导作为判据，避免仅凭体外数据选择先导方案 |
| 患者来源细胞药效评价 | 临床级电转平台＋流式细胞术＋IE-HPLC＋异种移植 | 同时读取植入、分化、编辑效率与 HbF 水平，评估疗效与造血毒性 |
| HbF 诱导均一性评估 | 流式细胞术＋单细胞蛋白质印迹＋单细胞 RNA 测序 | 三种方法动态范围和灵敏度不同，可交叉验证 HbF 诱导广度与转录异质性 |
| 功能表型确认 | 细胞分选＋低氧孵育＋活细胞成像 | 将 HbF 水平转化为镰状化下降的功能读数，补足分子指标 |
| 脱靶与结构变异筛查 | CHANGE-seq＋靶向扩增子测序＋ddPCR＋长读长测序＋UDiTaS | 从无偏发现到靶向确认，覆盖小插入缺失、大片段缺失与重排 |
适用前提是具备 CD34+ 细胞动员、分选与体外红系分化能力，并具备异种移植与相应动物伦理条件。若研究目标仅为编辑效率初筛，可先以电转加测序完成，但涉及药效结论时，体内移植数据更稳妥。脱靶评估中，CHANGE-seq 定位的是体外切割活性，是否能转化为细胞内脱靶仍需靶向测序确认。对于不同编辑工具，如碱基编辑或先导编辑，其安全性评价侧重点不同，本组合中的结构变异检测层级需相应调整。
文献信息
Katta V, O'Keefe K, Li Y, et al. Development and IND-enabling studies of a novel Cas9 genome-edited autologous CD34+ cell therapy to induce fetal hemoglobin for sickle cell disease. Molecular Therapy, 2024. PMID: 39086133. DOI: 10.1016/j.ymthe.2024.07.022.