Western blotting 与流式细胞术验证 MUC1 经 Wnt/β-catenin 通路调控 GDM 滋养层细胞凋亡与糖摄取

妊娠糖尿病（GDM）患者的胎盘滋养层细胞常出现糖摄取障碍与凋亡异常，但上游调控机制尚未完全明确。该研究以 MUC1 为切入点，假设其通过 Wnt/β-catenin 通路参与 GDM 滋养层功能障碍。研究采用临床胎盘与血浆样本结合 HTR-8/SVneo 细胞模型，以 Western blotting 检测通路蛋白与凋亡/糖摄取相关蛋白表达，以流式细胞术定量细胞凋亡与细胞周期，以免疫荧光定位 MUC1 与 GLUT4 在组织与细胞中的表达，以 ELISA 检测血浆可溶性指标，并通过 sh-MUC1 敲低与 FH535 抑制剂干预，构建从关联到因果的验证链条。核心仪器技术分别承担蛋白定量、细胞表型分群、空间定位与循环标志物检测的角色，共同支撑 MUC1-Wnt/β-catenin-滋养层功能障碍这一结论。

实验流程

关键环节

临床样本中 MUC1 表达升高与滋养层功能障碍的关联确认

研究首先需要确认 GDM 患者胎盘中 MUC1 是否异常升高，并同步评估糖摄取与凋亡状态。ELISA 用于检测母体血浆中 MUC1、GLUT1、GLUT4 水平，结果显示 GDM 组血浆 MUC1 显著升高，GLUT1 与 GLUT4 降低。q-PCR 与 Western blotting 分别从 mRNA 和蛋白水平确认 GDM 胎盘 MUC1 表达高于正常胎盘。免疫荧光双染 MUC1 与 GLUT4 显示，GDM 胎盘滋养层细胞中 MUC1 平均荧光强度升高而 GLUT4 降低，为两种蛋白在同一细胞区域的反向表达提供了空间证据。Western blotting 进一步显示 GDM 胎盘中 GLUT4、INSR、Bcl-2 降低，Caspase3 升高，说明糖摄取障碍与凋亡促进同时存在。该环节通过 ELISA、q-PCR、Western blotting 与免疫荧光的数据互相印证，建立了 MUC1 高表达与滋养层功能障碍之间的临床关联。

Wnt/β-catenin 通路在 GDM 胎盘中的激活状态确认

在确认 MUC1 升高后，研究需要判定 Wnt/β-catenin 通路是否处于激活状态。Western blotting 检测胎盘组织中的 β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、Wnt3a 及下游靶基因 TCF4、c-Myc、CyclinD1。结果显示 GDM 胎盘中 β-catenin 和 p-β-catenin 升高，GSK-3β 和 p-GSK-3β 降低，Wnt3a 呈升高趋势，TCF4、c-Myc、CyclinD1 均升高。β-catenin 积累与 GSK-3β 抑制是通路激活的典型表现，下游靶基因上调则提示转录活性增强。该环节的数据将 MUC1 升高与通路激活在临床样本层面联系起来，但尚不能确定因果关系。

高糖环境下抑制 Wnt/β-catenin 通路对滋养层功能障碍的逆转

为验证通路激活是否是功能障碍的直接原因，研究在 HTR-8/SVneo 细胞中用 30 mM 高糖模拟 GDM 环境，并加入 FH535 抑制 Wnt/β-catenin 通路。免疫荧光显示高糖组 GLUT4 荧光强度降低，FH535 处理后回升。q-PCR 显示高糖组 GLUT1、GLUT3、GLUT4、GLUT8 及 INSR、INS1、INS2、AKT、FOXO1 均降低，FH535 组则有效逆转。Western blotting 进一步显示高糖组 GLUT4、INSR、Bcl-2 降低而 Caspase3 升高，FH535 处理后上述变化被逆转。该环节通过药理学抑制结合免疫荧光、q-PCR 与 Western blotting，说明阻断 Wnt/β-catenin 通路可改善高糖诱导的糖摄取障碍与凋亡，为通路的功能必要性提供了干预证据。

MUC1 敲低对滋养层细胞表型的影响

研究需要明确 MUC1 本身对滋养层细胞行为的调控作用。Western blotting 与 q-PCR 确认 sh-MUC1 转染后 MUC1 表达显著降低，sh-NC 组与对照组无显著差异。流式细胞术 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测显示 MUC1 敲低组凋亡细胞比例降低；PI 细胞周期检测显示 G2 期细胞比例发生变化；划痕实验显示 MUC1 敲低促进 HTR-8/SVneo 细胞迁移。流式细胞术在此承担细胞群体水平的凋亡与周期定量，划痕实验提供迁移能力数据。该环节说明 MUC1 表达水平与滋养层细胞凋亡、周期和迁移直接相关，为后续通路机制研究提供了功能表型基础。

MUC1 敲低对高糖诱导的糖摄取障碍与凋亡的逆转

在明确 MUC1 功能后，研究需要验证 MUC1 是否在高糖环境中介导功能障碍。HTR-8/SVneo 细胞经 30 mM 高糖处理并敲低 MUC1，CCK-8 检测显示高糖组细胞活力下降，MUC1 敲低组活力回升，高糖联合 MUC1 敲低组活力恢复。Western blotting 显示高糖组 MUC1 升高，sh-MUC1 组 MUC1 降低，联合组 MUC1 表达被逆转；同时高糖组 GLUT4、INSR、Bcl-2 降低而 Caspase3 升高，MUC1 敲低可逆转这些变化。该环节通过 CCK-8 与 Western blotting 将 MUC1 表达水平与糖摄取、凋亡相关蛋白变化直接关联，说明 MUC1 是高糖诱导功能障碍所必需的。

MUC1 敲低对 Wnt/β-catenin 通路的抑制

为确定 MUC1 与 Wnt/β-catenin 通路的上下游关系，研究在高糖与 MUC1 敲低条件下检测通路蛋白。Western blotting 显示高糖诱导的 HTR-8/SVneo 细胞中 β-catenin、p-β-catenin 升高，GSK-3β、p-GSK-3β 降低，Wnt3a、TCF4、c-Myc、CyclinD1 升高，与 GDM 胎盘趋势一致；MUC1 敲低后上述变化被逆转，β-catenin 与 p-β-catenin 降低，GSK-3β 与 p-GSK-3β 回升，下游靶基因下降。该环节通过 Western blotting 证明 MUC1 敲低可抑制高糖激活的 Wnt/β-catenin 通路，结合前述 FH535 干预结果，形成 MUC1 位于通路上游、通路激活导致功能障碍的证据链。

技术协同

研究组合

文献信息

Cui SS, Zhang P, Sun L, et al. Mucin1 induced trophoblast dysfunction in gestational diabetes mellitus via Wnt/β-catenin pathway. Biol Res. 2023;56(1):48. doi:10.1186/s40659-023-00460-3. PMID: 37608294.