特发性肺纤维化（IPF）中，肌成纤维细胞是产生细胞外基质（ECM）的主要效应细胞，而 FKBP10 作为前胶原分子伴侣在 IPF 中上调并主要定位于肌成纤维细胞。本研究构建了靶向肌成纤维细胞的 RDYH58 修饰外泌体（RDYH58-exo），采用超声微流控方法将靶向 FKBP10 的小干扰 RNA（siFKBP10）装载其中，形成 RDYH58-siFKBP10 递送系统，并在体外 BLM 诱导的纤维化细胞模型和体内 IPF 小鼠模型中评价其抗纤维化药效。
研究路线覆盖外泌体制备与表征、siRNA 装载效率与稳定性验证、体外靶向摄取与基因沉默评价、体内雾化给药后的肺部分布与组织学分析、羟脯氨酸含量测定以及 RNA-seq 机制解析。核心仪器技术包括超声微流控装载系统、透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、激光扫描共聚焦显微镜、小动物活体成像系统、活细胞成像系统和组织学与免疫组化平台，它们分别承担装载、表征、靶向验证、药效评价和机制补充的角色，形成从递送系统构建到药效证据链的完整闭环。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 外泌体制备与工程化修饰 | 质粒转染、差速超速离心、BCA 蛋白定量 | 获得表达 RDYH58-Lamp2b-HA 融合蛋白的外泌体 | 外泌体蛋白浓度、HA 标签表达 |
| 外泌体形态与粒径表征 | TEM、NTA、DLS | 确认外泌体形态、粒径分布及装载前后变化 | TEM 图像、粒径分布、zeta 电位 |
| siFKBP10 装载与负载效率 | 超声微流控、Quant-iT RiboGreen RNA 检测 | 将 siFKBP10 装载入外泌体并量化装载效率 | 装载效率、雾化前后 siRNA 保留率 |
| 体外 BLM 纤维化模型与靶向摄取 | WB、激光扫描共聚焦显微镜、DiO 标记 | 验证肌成纤维细胞转化及 RDYH58-exo 靶向摄取 | α-SMA、FKBP10 表达、荧光强度 |
| 体外基因沉默与表型评价 | WB、免疫荧光、活细胞成像系统 | 评价 siFKBP10 对 ECM 蛋白和细胞迁移的抑制 | α-SMA、FKBP10、COL-1、FN 表达、迁移率 |
| 体内雾化给药与肺部分布 | 小动物活体成像系统、免疫荧光 | 观察雾化外泌体在肺内分布及细胞类型共定位 | 荧光信号分布、Pearson R 值 |
| 体内药效与胶原含量评价 | H&E、Masson、Sirius Red 染色、羟脯氨酸检测、WB、免疫组化 | 评价 RDYH58-siFKBP10 对肺纤维化和胶原沉积的抑制 | 组织学评分、胶原面积、羟脯氨酸含量、蛋白表达 |
| 机制解析 | RNA-seq、KEGG/GO 富集分析 | 揭示 FKBP10 调控的下游通路和差异基因 | 差异表达基因、富集通路 |
关键环节
外泌体制备与工程化修饰环节解决的是递送系统靶向性的来源问题。研究将 RDYH58 肽段与 Lamp2b 融合表达于 HEK293F 细胞，通过差速超速离心分离外泌体。Western blotting 使用 anti-HA 抗体确认 RDYH58-Lamp2b-HA 在 RDYH58-exo 中表达，而未修饰外泌体（unm-exo）不表达该标签；同时两组外泌体均表达 CD63、TSG101、CD81 和 CD9 等外泌体阳性标志物。该数据说明工程化修饰未改变外泌体基本身份，为后续靶向功能评价提供物质基础。
siRNA 装载与负载效率环节解决的是核酸药物如何稳定进入外泌体的问题。研究采用超声微流控方法，将外泌体与 siRNA 按 1:1 质量比混合，在自动注射泵 200 μL/min 流速和 30 W 超声功率下装载，使用 Quant-iT RiboGreen RNA 检测试剂盒定量总 siRNA。结果显示 RDYH58-exo 和 unm-exo 雾化前装载效率分别为 32.2% 和 34.8%，雾化后降至 28.2% 和 27.7%；TEM 显示外泌体保持球形，NTA 测得粒径为 92.5～99.8 nm，装载和雾化后粒径仅有轻微变化。琼脂糖凝胶电泳显示外泌体装载的 siRNA 在 6 h 内仍可检出，说明 RDYH58-siFKBP10 具有增强的稳定性。这些数据共同说明超声微流控装载未明显破坏外泌体结构，且 siRNA 在雾化前后保持可接受的保留率，为后续体内给药提供质量依据。
体外 BLM 纤维化模型与靶向摄取环节解决的是递送系统能否识别并进入肌成纤维细胞的问题。研究用不同浓度 BLM（0.5、1.0、2.0 μg/mL）诱导 HFL-1 细胞 48 h，Western blotting 显示在 1.0 μg/mL 时 α-SMA 和 FKBP10 表达升高，确认肌成纤维细胞转化成功。随后用 DiO 标记 RDYH58-exo 和 unm-exo，在 2 h 和 6 h 通过激光扫描共聚焦显微镜观察细胞摄取。结果显示 RDYH58-exo 的摄取效率优于 unm-exo，说明 RDYH58 肽段赋予外泌体对肌成纤维细胞的靶向能力。
体外基因沉默与表型评价环节解决的是 siFKBP10 进入细胞后能否有效抑制纤维化表型的问题。研究设置 PBS、RDYH58-exo、RDYH58-siNC、裸 siFKBP10、unm-siFKBP10 和 RDYH58-siFKBP10 等处理组，BLM 诱导后培养 48～72 h。Western blotting 和免疫荧光显示 RDYH58-siFKBP10 显著降低 FKBP10、α-SMA、COL-1 和 FN 表达，细胞划痕实验通过活细胞成像系统记录 0 h 和 24 h 迁移情况，显示 RDYH58-siFKBP10 处理组迁移率降低。该环节的数据说明靶向递送 siFKBP10 可同时抑制肌成纤维细胞活化和 ECM 蛋白沉积，并抑制细胞迁移。
体内雾化给药与肺部分布环节解决的是递送系统在体内能否富集于肺和靶细胞的问题。研究在 BLM 诱导后第 14 天对 BALB/c 小鼠经气管雾化给予 DiO 标记外泌体，使用小动物活体成像系统在 4 h 及第 1、3、5、7 天观察分布，荧光信号在第 3 天后逐渐减弱。在 C57BL/6 小鼠中，给药后第 1 天荧光主要分布于肺组织。肺组织冰冻切片免疫荧光显示 RDYH58-exo 与 α-SMA 标记的肌成纤维细胞共定位强于 unm-exo，与上皮细胞和内皮细胞共定位较弱，同时与 CD68 标记的巨噬细胞也有较强共定位。该数据支持 RDYH58-exo 在体内优先靶向肌成纤维细胞，为 siFKBP10 递送至效应细胞提供依据。
体内药效与胶原含量评价环节解决的是 RDYH58-siFKBP10 能否在动物模型中缓解纤维化的问题。研究在 BLM 暴露后第 7 天开始经气管雾化给药，每 3 天一次，共 5 次，剂量为 1.5 mg/kg。结果显示 RDYH58-siFKBP10 减轻肺组织充血和坏死，降低肺重量；H&E、Masson 三色和 Sirius Red 染色显示其改善 BLM 诱导的广泛纤维组织增生和肺泡间隔增厚；羟脯氨酸检测显示 RDYH58-siFKBP10 显著下调肺内羟脯氨酸含量，说明胶原积累受到抑制。Western blotting 显示 FKBP10、COL-1、FN 和 α-SMA 表达降低，免疫组化显示 FN 和 α-SMA 在过度 ECM 中的表达减少。这些数据构成体内药效的核心证据链。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 制备与表征互补 | 超声微流控、TEM、NTA、DLS | 超声微流控完成 siRNA 装载，TEM 和 NTA 分别从形态和粒径分布角度验证装载前后外泌体完整性，DLS 补充 zeta 电位变化，共同确认递送系统质量。 |
| 体外靶向与体内靶向验证 | 激光扫描共聚焦显微镜、小动物活体成像系统、免疫荧光 | 共聚焦显微镜在细胞水平验证 RDYH58-exo 摄取优于 unm-exo，活体成像和肺组织免疫荧光在动物水平验证其肺内分布和肌成纤维细胞共定位，形成体外到体内的靶向证据递进。 |
| 蛋白表达与组织学相互印证 | Western blotting、免疫组化、H&E/Masson/Sirius Red 染色、羟脯氨酸检测 | Western blotting 定量 FKBP10、COL-1、FN、α-SMA 表达，组织学染色展示纤维化结构改变，羟脯氨酸反映全肺胶原含量，三类数据从分子、结构和生化层面相互支持药效结论。 |
| 表型评价与机制解析衔接 | 活细胞成像系统、RNA-seq、KEGG/GO 富集分析 | 划痕实验提供细胞迁移表型数据，RNA-seq 揭示差异表达基因和 ECM-receptor interaction、PI3K-Akt 等通路，为表型变化提供转录组层面的机制解释。 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 外泌体载药系统构建与质量表征 | 超声微流控 + TEM + NTA + DLS + Western blotting | 适用于需要将 siRNA 装载入工程化外泌体并确认装载效率、粒径形态和标志物表达的研究。前提是外泌体来源细胞可稳定表达融合蛋白，且装载后需评估雾化或给药方式对粒径和负载稳定性的影响。 |
| 靶向递送系统的细胞水平摄取评价 | DiO 标记 + 激光扫描共聚焦显微镜 + 免疫荧光 | 适用于验证靶向肽修饰外泌体是否优先进入目标细胞类型。需设置未修饰外泌体对照，并注意区分外泌体自身趋化性与靶向肽贡献。 |
| 肺纤维化动物模型的药效评价 | 小动物活体成像系统 + 组织学染色 + 羟脯氨酸检测 + Western blotting + 免疫组化 | 适用于经雾化或气管给药后评价肺内分布、组织结构和胶原沉积变化。前提是动物模型诱导时间和给药窗口需与文献一致或经过预实验确认。 |
| 药效机制补充解析 | RNA-seq + KEGG/GO 富集分析 + 下游蛋白验证 | 适用于在表型明确后探索差异基因和信号通路。需要注意测序结果需通过 Western blotting 或免疫组化对关键通路蛋白进行验证，不宜仅凭转录组数据下结论。 |
在类似研究中，若研究目标是评价靶向递送系统对特定细胞类型的药效，可优先借鉴本研究的层级验证思路：先以外泌体标志物和靶向标签确认载体身份，再以装载效率、粒径和稳定性确认载药质量，随后在细胞水平验证靶向摄取和基因沉默，最后在动物模型中结合分布、组织学和生化指标评价药效。需要注意的是，超声微流控装载效率受外泌体与 siRNA 比例、流速和超声功率影响，不同来源外泌体的膜蛋白组成和粒径分布也可能影响装载和靶向效果，因此具体参数需要根据自身体系优化。此外，本研究中雾化外泌体的肺部递送效率缺乏空气动力学表征，在类似研究中若需精确评估到达肺部的实际比例，可能需要补充雾化粒径和空气动力学粒径分布等数据。
文献信息
Yuan R, Mu Z, Zhang H, et al. RDYH58 functional exosomes targeting myofibroblasts loaded with siFKBP10 for inhibition of collagen biosynthesis and secretion of IPF. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2025. DOI: 10.1016/j.apsb.2025.08.017. PMID: 41477319.