脊髓腹角运动神经元是运动输出的最后通路，从该区域获取稳定的单细胞信号，对运动意图解码和脊髓功能调控具有直接价值。但脊髓组织柔软且随呼吸、运动持续形变，传统刚性电极与组织之间存在显著机械失配，长期植入后易出现电极漂移、胶质瘢痕和信号衰减，同时高通道数采集带宽也限制了单细胞分辨率的发挥。该研究基于微纳加工制备了超柔性脊髓电极阵列（SHEA），通过降低电极厚度与弯曲刚度来减小界面机械失配，并在小鼠脊髓腹角完成长期植入，系统评估了阻抗、信噪比（SNR）、单细胞产量、组织相容性，以及基于尖峰和局部场电位（LFP）的运动解码效果和 PCA 神经轨迹。核心仪器与技术承担的作用可归纳为：微纳加工决定电极的柔性、通道密度与记录位点布局；Intan RHD 2000 采集系统完成脊髓信号的采集与阻抗测量；免疫组化和步态分析分别从组织与行为层面验证植入安全性；LSTM 解码和 PCA 则把电生理数据转化为运动轨迹预测和低维神经动力学描述。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| SHEA 设计与制备 | 光刻、电子束蒸发、SU-8 或 PI 绝缘层、钛/金导电层 | 降低电极刚度，实现高通道密度和细胞尺度空间分辨率 | 电极结构参数、显微图像、弯曲力与柔性对比数据 |
| SHEA 植入手术 | 立体定位仪、钨针辅助植入、聚乙烯 glycol 溶解脱针、硅弹性体封装 | 减小手术轨迹，将柔性电极单独留在脊髓组织内 | 植入位置图像、电极轨迹尺寸 |
| 长期电生理记录 | Intan RHD 2000 采集系统、128 通道 headstage | 获取脊髓腹角单细胞信号并评估长期稳定性 | 原始信号、阻抗、SNR、单细胞产量、尖峰幅度、单元波形 |
| 组织相容性验证 | 免疫组化、共聚焦激光扫描显微镜 | 评估星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元反应 | GFAP、CD68、NeuN、DAPI 染色图像及阳性面积、厚度定量 |
| 行为影响评估 | 100 fps 摄像机、Visual Gait Lab 步态分析 | 判断植入是否影响小鼠运动功能 | 站立宽度、摆动时间、步幅时间、步态对称性 |
| 运动解码 | 工业摄像机、DeepLabCut、LSTM 神经网络 | 从脊髓尖峰和 LFP 重建后肢关节运动轨迹 | 关节坐标、解码 R²、实际值与预测值分布 |
| 神经轨迹分析 | PCA | 揭示运动过程中尖峰和 LFP 的低维神经动力学模式 | 3D/2D 神经轨迹、摆动相与站立相几何模式 |
关键环节
电极制备环节的目标是在保持高通道密度的同时降低机械失配。SHEA-128 探针包含四条 5 mm 长 shank，厚度 1 µm，平均宽度 100 µm，每条 shank 上 32 个直径 20 µm 的圆形记录位点沿远端 480 µm 分两列均匀分布；SHEA-64 结构类似，平均宽度 50 µm，记录位点直径 30 µm，沿远端 630 µm 分布。多层探针通过光刻和电子束蒸发在硅片释放层上制备，电极与互连层采用钛和金，绝缘层使用 SU-8 或 PI。相比传统刚性脊髓电极，SHEA 的探针体积降低数个数量级，柔性显著提升，记录位点数量增加。这一环节的数据直接支撑了后续长期、高通量记录的可行性判断：电极的厚度和宽度参数决定了其在脊髓运动环境中的弯曲力和扭矩，而通道密度和位点尺寸则决定了单细胞采样的空间分辨率。
植入手术环节解决的是柔性电极如何在尽量减少组织损伤的前提下进入深部脊髓。研究采用钨针辅助植入，将 SHEA 附着于钨针后垂直插入脊髓，到达目标位置后通过生理盐水溶解聚乙烯 glycol 使钨针脱离，再撤出钨针，仅将柔性电极留在组织内。手术轨迹被控制在数十微米量级。该环节产生的植入位置图像和轨迹数据，是后续解释组织反应范围和记录位点覆盖区域的基础。对实验人员来说，柔性电极的植入通常需要在刚性支撑和最小组织损伤之间取得平衡，该研究中钨针辅助加可溶解固定的方式提供了一个可参考的操作路径。
长期电生理记录环节的目标是验证 SHEA 能否在数周至数月尺度上稳定获取脊髓腹角单细胞信号。研究将 SHEA-128 或 SHEA-64 植入 5 只小鼠脊髓腹角，覆盖 L1 至 L2 节段，记录持续 9 周、共 18 次，每周两次。Intan RHD 2000 系统以 20 kHz 采样率采集信号，同时在同一系统下以 1 kHz 测量电极阻抗。结果显示，电极平均阻抗在植入后逐渐升高并于 4 周后稳定在约 1 MΩ；多数记录位点 SNR 在 9 周内相对稳定在 10～30；每根探针检测到的单细胞数量在前 3 周稳定在约 32 个，随后 6 周降至约 12 个；各小鼠单元活动平均幅度在 89～260 µV。这些数据表明 SHEA 在长期记录中维持了可用的阻抗、SNR 和单细胞产量，是支持“长期稳定记录”结论的直接电生理证据。
单细胞分离与多采样环节解决的是如何提高单元产量和分离准确性。由于记录位点间距小于单细胞检测范围，同一个单细胞可被多个位点采样。研究中 91% 的单细胞可被 160 µm 距离内的电极位点捕获，SHEA-128 约为 12 个记录位点，SHEA-64 约为 5 个记录位点。单细胞占所有记录单元的比例为 83 ± 13%，其中 SHEA-128 为 96 ± 3%，SHEA-64 为 75 ± 10%。在所有记录场次中，55% 的单细胞捕获位点可捕获两个或更多单细胞。该数据说明多采样能力提高了单细胞产量和分离准确度，也为长期追踪同一单元提供了条件：研究中三个记录位点在连续 9 周内可提取稳定单元波形，植入一年后仍可采集到脊髓内单细胞。
组织相容性验证环节的目标是判断长期植入是否引起持续炎症或神经元损伤。研究在植入后 2 周、2 个月和 4 个月对脊髓切片进行 GFAP、CD68、NeuN 和 DAPI 染色，使用共聚焦激光扫描显微镜成像，并以 ImageJ 定量植入位点周围约 160 µm 直径范围内的阳性面积和免疫反应层厚度。2 周时 GFAP+ 和 CD68+ 比例显著高于假手术组，2 个月时较 2 周显著降低，4 个月时恢复至基线水平；GFAP+ 和 CD68+ 免疫反应层厚度从 2 周时的约 15 µm 降至 5～10 µm；NeuN 神经元计数在假手术组、2 周组和 2 个月组之间无显著差异。这些数据表明植入引起的免疫反应随时间缓解，支持 SHEA 可与脊髓组织长期共存。
行为影响评估环节解决的是植入是否干扰小鼠正常运动。研究在术前 1 天及术后 1、3、7 天对 5 只小鼠进行步态分析，使用 100 fps 摄像机记录透明通道内的行走过程，并通过 Visual Gait Lab 提取站立宽度、摆动时间、步幅时间和步态对称性。结果显示四项指标在实验时间进程中均无显著变化。结合组织学结果，该环节从行为层面支持“植入诱导可忽略行为影响”的结论。
运动解码环节的目标是检验 SHEA 记录的脊髓腹角信号能否预测后肢运动轨迹。研究在两只小鼠 L3 节段腹角植入 SHEA-128，使用 60 fps 工业摄像机记录轮跑任务中的后肢运动，并通过 DeepLabCut 提取趾、踝、膝、髋、髂五个关节的 x、y 坐标；脊髓信号以 20 kHz 采集，并通过数字触发与摄像机时间戳同步。原始信号经共模中值参考、300～6000 Hz 带通滤波后提取尖峰，经 1～300 Hz 滤波后提取 LFP，并进一步分为 1～4、4～8、8～12、12～30、30～90、90～200、200～300 Hz 七个频段。采用 LSTM 神经网络进行解码，以 R² 评估。尖峰信号解码精度可达 0.95，解码结果与实际值分布相似；1～4 Hz LFP 的解码 R² 与尖峰相当或略优，而尖峰在 30～90 Hz、90～200 Hz 和 200～300 Hz 频段显著优于 LFP。该环节的数据支持“脊髓腹角多单元信号可预测运动轨迹”的结论，并提示不同频段 LFP 携带的运动信息存在差异。
神经轨迹分析环节的目标是从低维空间描述脊髓信号与运动相位的关系。研究使用 PCA 对运动期间的尖峰和不同频段 LFP 进行降维，可视化前三个和前两个主成分。结果显示，尖峰呈现周期性圆形轨迹，1～4 Hz LFP 呈鞍形轨迹，4～8 Hz 和 8～12 Hz LFP 呈结形轨迹，且在步态周期的摆动相和站立相重复旋转；当动物在运动和静止状态之间切换时，PCA 空间中的神经轨迹出现明显状态变化。高频 LFP 未观察到明显几何模式。该数据与解码结果一致，支持尖峰和低频 LFP 在腹角脊髓中更有效地编码后肢运动，并提示脊髓神经动力学在低维空间中具有特定几何结构和周期性振荡。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程支撑 | 微纳加工、立体定位仪、Intan RHD 2000 | 微纳加工决定电极的柔性、通道数和位点布局，植入手术将电极送达腹角，采集系统获取信号并测量阻抗；前者为后者提供物理和电学基础 |
| 互补验证 | 免疫组化、步态分析 | 免疫组化从组织层面评估炎症和神经元状态，步态分析从行为层面评估运动功能；两者共同支持植入安全性的结论 |
| 数据互补 | 尖峰信号、LFP 分频段分析 | 尖峰提供单细胞分辨率的运动信息，低频 LFP 提供与运动相位相关的场电位信息；两者在解码和 PCA 轨迹中呈现不同但互补的模式 |
| 验证关系 | LSTM 解码、PCA 神经轨迹 | 解码结果说明尖峰和低频 LFP 对运动预测更有效，PCA 轨迹进一步揭示其在低维空间中的周期性几何模式；两类分析从预测能力和动力学结构两个角度相互印证 |
| 干预与评估 | SHEA 植入、长期电生理记录 | 植入是获取信号的前提，长期记录数据用于评估电极性能随时间的变化，二者共同构成电极可靠性的证据链 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 脊髓深部长期单细胞记录 | 超柔性多通道电极阵列、立体定位仪、多通道电生理采集系统 | 柔性电极降低机械失配，立体定位保证植入精度，采集系统提供高采样率和阻抗监测；适合需要数周至数月稳定单细胞信号的研究 |
| 植入安全性评估 | 免疫组化染色、共聚焦激光扫描显微镜、步态分析摄像系统 | 组织学和步态分析分别从炎症反应和运动行为两个层面评估植入影响；适合长期植入类研究的安全性验证 |
| 运动解码与神经动力学分析 | 高速摄像机、DeepLabCut、多通道电生理采集系统、LSTM、PCA | 行为追踪与神经信号同步采集，解码模型评估预测能力，PCA 揭示低维动力学结构；适合运动相关神经信号的信息含量和编码模式研究 |
在类似研究中，若研究目标是脊髓或深部神经结构的长期记录，可优先考虑柔性电极与多通道采集系统的组合，前提是电极的植入路径和固定方式能够尽量减少组织损伤；若研究关注信号与行为的关系，则需要保证神经信号与行为视频的时间同步，并根据目标运动频段选择尖峰或相应频段 LFP 作为分析对象。需要注意的是，该研究中 SHEA 的性能数据来自小鼠脊髓腹角，适用前提是脊髓组织环境和植入方式相近；不同物种、不同脊髓节段或不同运动任务下，阻抗、单细胞产量和解码表现可能不同。更稳妥的理解是，柔性电极主要解决机械失配带来的长期稳定性问题，而解码精度和神经轨迹模式需要结合具体任务和信号类型进行评估。
文献信息
Fan J, Li X, Wang P, et al. A Hyperflexible Electrode Array for Long-Term Recording and Decoding of Intraspinal Neuronal Activity. Adv Sci (Weinh), 2023. PMID: 37870208. DOI: 10.1002/advs.202303377.