慢性乙型肝炎功能性治愈的主要障碍在于持续高水平的HBsAg所驱动的免疫耐受微环境，以及共价闭合环状DNA（cccDNA）的长期存在。传统治疗性抗体虽能快速清除外周抗原，但多数情况下停药后病毒反弹，提示单纯降低抗原负荷不足以恢复持久免疫控制。本研究构建了SHARP（Specific HBV Antigen-capturing and Rendering Promotor）疫苗平台，将靶向HBsAg与DEC-205的双特异性抗体与TLR7/8激动剂偶联，在AAV-HBV慢性携带小鼠中评估其逆转免疫耐受并建立持久病毒控制的能力。实验路线以流式细胞术和单细胞RNA测序为核心评价手段，前者用于追踪DC抗原摄取与提呈、T细胞活化与记忆表型、B细胞分化及抗体分泌，后者用于解析脾脏免疫细胞亚群的转录组变化和IgG类别转换，二者与血清学、肝脏病毒学指标共同构成药效证据链。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| SHARP构建与偶联表征 | LC-MS、SDS-PAGE | 确认抗体-激动剂偶联效率与药物抗体比 | DAR值、偶联产物纯度 |
| DC抗原捕获与吞噬 | 流式细胞仪（BD LSRFortessa X-20）、pHrodo标记 | 评价SHARP是否增强DC对HBsAg的摄取与内吞 | HBsAg-488阳性细胞比例、吞噬荧光强度 |
| DC成熟与抗原提呈 | 流式细胞术（CD80/CD86/CD40、SIINFEKL/H-2Kb） | 判断SHARP是否促进DC成熟及交叉提呈 | 成熟标志物gMFI、抗原肽提呈比例 |
| 抗原特异性T细胞活化 | 流式细胞术（CD25、CD69） | 验证SHARP激活的DC能否启动抗原特异性T细胞 | OT-I/OT-II T细胞活化标志物表达 |
| AAV-HBV小鼠药效评价 | ELISA、化学发光仪（Wan 200+）、实时荧光定量PCR（CFX96） | 评估SHARP对血清HBsAg、anti-HBsAg、HBV DNA及肝脏病毒标志物的长期控制 | HBsAg滴度、anti-HBsAg水平、HBV DNA/RNA拷贝数、HBeAg |
| 体外中和与再感染 | HepG2-hNTCP细胞、化学发光仪、实时荧光定量PCR | 检测治疗血清是否具有HBV中和活性及对再感染的抵抗 | HBeAg水平、HBV-RNA定量、再感染后HBsAg滴度 |
| 免疫细胞亚群与功能分析 | 光谱流式细胞仪（ID7000）、FlowSOM、t-SNE | 追踪Tfh、PC、GC B细胞、Tem、Treg、DN T细胞动态，评估细胞毒功能 | 各亚群比例与数量、CD107a/GZMB/穿孔素表达、IFN-γ分泌 |
| 脾脏转录组与Ig类别转换 | 单细胞RNA测序（GEXSCOPE）、免疫受体库建库 | 解析GC B细胞和PC中IgG相关基因表达变化 | Ighg1/Ighg2b/Ighg3与Igha表达水平 |
| 抗体分泌细胞与免疫记忆 | ELISpot、CTL S6 Universal Analyzer、流式细胞术 | 量化anti-HBsAg分泌B细胞及记忆B/T细胞亚群 | 斑点形成细胞数、记忆B细胞比例、Trm/Tem比例 |
关键环节
DC抗原捕获与提呈能力的流式评价
SHARP设计的核心在于让DC主动内化内源性病毒抗原，同时共递送TLR7/8激动剂以重编程免疫抑制状态。实验以DyLight 488标记HBsAg，与SHARP或对照抗体共孵育后通过BD LSRFortessa X-20流式细胞仪检测DC对HBsAg-488的摄取。pHrodo标记法则用于区分表面结合与内吞后溶酶体降解的抗原。结果显示SHARP处理组DC的抗原吞噬能力显著高于对照单抗和双特异性抗体，同时CD80、CD86、CD40表达上调，SIINFEKL/H-2Kb提呈增加。这些数据从细胞层面证明SHARP能够同时增强抗原捕获、DC成熟和抗原提呈，为后续T细胞活化提供直接前提。
T细胞活化与细胞毒功能的流式追踪
免疫耐受逆转的关键在于恢复HBV特异性T细胞应答。实验将SHARP激活的BMDC与OT-I或OT-II T细胞共培养，以流式细胞术检测CD25和CD69表达，确认抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞被有效启动。在AAV-HBV小鼠中，通过CD4+或CD8+ T细胞清除实验发现，CD4+ T细胞缺失完全阻断SHARP介导的HBsAg下降和anti-HBsAg产生，CD8+ T细胞清除则部分削弱疗效，说明体液与细胞免疫协同参与。光谱流式细胞仪结合FlowSOM和t-SNE分析进一步显示，SHARP治疗后脾脏CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞和CD8+ Tem的细胞毒评分升高，HBsAg和HBcAg肽池刺激后CD107a、GZMB和穿孔素表达增强，IFN-γ分泌增加而TNF-α保持稳定。这些指标共同说明SHARP恢复了抗原特异性细胞毒功能与非细胞溶解性抗病毒机制。
B细胞分化与抗体应答的流式与单细胞解析
持久病毒控制需要功能性抗体应答。流式细胞术动态监测显示，SHARP治疗后第一周内脾脏Tfh细胞、PC和GC B细胞比例即快速升高并维持在基线以上；免疫荧光观察到脾脏淋巴滤泡区GL7和Ki67表达增强，提示活跃生发中心形成。单细胞RNA测序对脾脏细胞的转录组分析发现，PC和GC B细胞中Ighg1、Ighg2b、Ighg3显著上调而Igha下调，表明SHARP促进B细胞类别转换向IgG亚类分化。ELISpot检测进一步证实anti-HBsAg分泌B细胞数量显著增加。这些数据从转录组和蛋白分泌两个层面支持SHARP驱动系统性保护性抗体应答。
免疫记忆与再感染抵抗
功能性治愈的持久性取决于免疫记忆的建立。在SHARP治疗实现HBsAg清除的小鼠中，第170天以相同剂量AAV-HBV再感染，1个月后外周血HBsAg仍维持低水平，说明治愈小鼠抵抗病毒再感染。流式细胞术检测到记忆B细胞比例和数量在免疫后期增加，脾脏和肝脏中CD4+ Tem、CD8+ Tem和CD4+ Trm比例显著升高，同时Treg和耗竭T细胞未见增加。这些结果说明SHARP诱导的记忆应答具有功能性和非耗竭特征，为长期控制HBV感染提供了细胞学证据。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 互补关系 | 流式细胞术与单细胞RNA测序 | 流式细胞术提供细胞亚群比例、表型和功能蛋白表达的动态数据，单细胞RNA测序提供同一组织内细胞亚群的转录组信息和Ig类别转换证据，二者从蛋白和转录本两个层面相互印证 |
| 验证关系 | ELISA/化学发光仪与流式细胞术 | 血清HBsAg和anti-HBsAg的ELISA/化学发光数据反映整体病毒学和体液免疫状态，流式细胞术检测的Tfh、PC、GC B细胞动态为抗体产生提供细胞学解释，二者构成因果链上的验证关系 |
| 干预关系 | CD4+/CD8+ T细胞清除与流式细胞术 | 通过抗体清除特定T细胞亚群后，再以流式细胞术和血清学指标评估药效变化，直接证明CD4+和CD8+ T细胞在SHARP疗效中的必要性 |
| 功能确认关系 | ELISpot与流式细胞术 | ELISpot量化anti-HBsAg分泌B细胞数量，流式细胞术确认记忆B细胞和PC表型，二者共同确认B细胞免疫记忆的功能状态 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 评价疫苗或免疫调节剂对DC抗原提呈功能的增强 | 流式细胞仪（多色荧光检测）+ pHrodo标记抗原 + 抗原肽-MHC提呈检测 | 同时获取抗原摄取、内吞和交叉提呈数据，区分表面结合与真实内化 |
| 追踪慢性感染模型中T细胞活化和记忆亚群动态 | 光谱流式细胞仪 + FlowSOM/t-SNE降维分析 + 肽池刺激功能检测 | 在高维度单细胞水平同时解析亚群比例、记忆表型和细胞毒功能 |
| 解析B细胞分化与抗体类别转换 | 流式细胞术（GC B/PC/记忆B标志物）+ 单细胞RNA测序 + ELISpot | 从细胞表型、转录组和分泌功能三个层面确认体液免疫应答质量 |
| 评估病毒学控制与免疫记忆持久性 | 实时荧光定量PCR + ELISA/化学发光仪 + 再感染模型 + 流式细胞术 | 将病毒学指标与记忆细胞群体关联，判断药效是否伴随功能性免疫记忆 |
需要注意的是，上述组合的适用前提是研究模型能够产生可检测的抗原特异性免疫应答，且流式抗体面板和单细胞测序样本制备需与目标细胞亚群匹配。单细胞RNA测序的成本和样本处理时效决定了其更适合在关键时间点取样，而非替代流式细胞术进行高频动态监测。在类似研究中，更稳妥的理解是将流式细胞术作为贯穿全程的表型与功能监测手段，将单细胞测序用于特定免疫细胞亚群的转录组深度解析，二者与血清学和病毒学指标共同构成药效评价的证据链。
文献信息
Chen X, Liu X, Xu T, et al. Engineered virus-hunter vaccine overcomes HBV immune tolerance. Gut. 2026. PMID: 41198172. DOI: 10.1136/gutjnl-2025-335806.