鹿科动物具有季节性发情和低繁殖力的生理特点，体外胚胎生产是种群扩繁和濒危物种保护的重要技术手段。卵母细胞质量直接影响后续胚胎发育和妊娠结局，而体外成熟环境与体内输卵管环境存在显著差异。本研究以梅花鹿输卵管上皮细胞来源的细胞外囊泡（DOEC-EVs）为干预对象，围绕卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的成熟过程，系统评估了DOEC-EVs对卵丘细胞（CCs）增殖、凋亡、氧化应激、线粒体功能及糖酵解的影响，并通过卵母细胞成熟率、第一极体排出率、氧化还原状态、线粒体膜电位及孤雌胚胎发育等指标，建立从囊泡摄取到胚胎发育的完整药效评价证据链。
实验路线以超速离心法提取DOEC-EVs为起点，依次通过纳米颗粒跟踪分析、透射电镜和蛋白质印迹完成囊泡鉴定；利用共聚焦显微镜追踪荧光标记囊泡在COCs中的摄取定位；随后以流式细胞术、CCK-8、EdU染色、荧光显微成像和代谢物检测综合评价卵丘细胞功能；最终通过电穿孔激活、体外胚胎培养和Hoechst染色，验证DOEC-EVs对孤雌胚胎发育的促进作用。共聚焦显微镜在该研究中承担了确定囊泡作用靶细胞的关键证据角色，流式细胞术和代谢检测则分别从细胞周期、凋亡和糖酵解层面提供了卵丘细胞功能变化的定量依据。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 输卵管上皮细胞分离培养与鉴定 | CO₂培养箱、免疫荧光染色、数字相机成像 | 确认所获细胞为鹿输卵管上皮细胞 | CK18 阳性细胞荧光图像 |
| 细胞外囊泡提取与表征 | 超速离心机、纳米颗粒跟踪分析、透射电镜、蛋白质印迹、酶标仪 | 确认囊泡浓度、粒径、形态及标志蛋白表达 | NTA 粒径分布与浓度、TEM 形态图像、CD9 蛋白条带 |
| 囊泡摄取定位 | 共聚焦显微镜、荧光标记 | 确定囊泡在卵丘-卵母细胞复合体中的摄取部位 | 卵丘细胞内红色荧光信号、卵母细胞内无信号 |
| 卵丘扩展与成熟率评价 | 体视显微镜、荧光显微镜、ImageJ 图像分析 | 评估囊泡对卵丘扩展和卵母细胞成熟的影响 | 卵丘面积变化、第一极体排出率 |
| 卵丘细胞增殖与周期分析 | 酶标仪、流式细胞术、EdU 染色、荧光显微镜 | 评价囊泡对卵丘细胞增殖和细胞周期的影响 | 450 nm 吸光度、S 期细胞比例、EdU 阳性细胞比例 |
| 卵丘细胞凋亡检测 | 流式细胞术、蛋白质印迹 | 评价囊泡对卵丘细胞凋亡的影响 | Annexin V/PI 凋亡率、caspase-9 蛋白条带 |
| 氧化应激与抗氧化能力检测 | 荧光显微镜、ImageJ 图像分析、实时荧光定量 PCR | 评价囊泡对卵丘细胞和卵母细胞氧化还原状态的影响 | ROS 荧光强度、GSH 荧光强度、SOD1 和 CAT mRNA 相对表达量 |
| 线粒体功能评价 | 免疫荧光染色、荧光显微镜、JC-1 染色、ATP 检测试剂盒、酶标仪、实时荧光定量 PCR | 评价囊泡对卵丘细胞和卵母细胞线粒体功能的影响 | TOM20 荧光强度、JC-1 红绿荧光比值、ATP 浓度、线粒体相关基因表达量 |
| 糖酵解代谢分析 | 酶标仪、代谢物检测 | 评价囊泡对卵丘细胞糖酵解活性的影响 | 丙酮酸消耗量、乳酸产生量、糖酵解相关基因表达量 |
| 孤雌胚胎发育评价 | 电穿孔仪、体外培养箱、荧光显微镜、ImageJ 图像分析 | 验证囊泡处理后的卵母细胞后续发育能力 | 卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数 |
关键环节
囊泡提取与鉴定
细胞外囊泡研究的首要前提是获得纯度可靠、表征完整的囊泡样品。本研究采用超速离心法从鹿输卵管上皮细胞条件培养基中提取DOEC-EVs，依次经 2000 × g、10 000 × g 和 100 000 × g 离心，结合 0.45 μm 膜过滤和 PBS 重悬，完成囊泡富集。纳米颗粒跟踪分析系统配备 405 nm 蓝色激光，通过捕捉囊泡布朗运动计算浓度和粒径分布，结果显示平均粒径为 85.9 nm。透射电镜在 110 kV 下观察到典型的杯状结构。蛋白质印迹检测到 EV 标志蛋白 CD9 的表达，阴性对照未检出，排除了细胞污染。上述三种技术从粒径、形态和蛋白标志物三个维度交叉验证了囊泡样品的可靠性，为后续功能实验提供了质量基础。
囊泡摄取定位
囊泡是否被靶细胞摄取、摄取后定位于何种细胞，直接决定后续功能指标的选择方向。本研究以亲脂性红色荧光染料标记DOEC-EVs，将标记囊泡以 1 × 10⁷/mL 加入COCs成熟培养体系，培养 28 h 后洗涤去除未内化囊泡，在共聚焦显微镜下观察荧光分布。结果显示，荧光信号仅出现在卵丘细胞内，卵母细胞内部未见囊泡进入。该结果提示DOEC-EVs可能通过卵丘细胞间接影响卵母细胞，因此后续功能评价将卵丘细胞作为核心检测对象，同时以卵母细胞成熟和胚胎发育作为终点验证指标。对实验人员而言，在囊泡功能研究中，前期摄取定位实验有助于避免将效应归因于错误的靶细胞类型。
卵丘扩展与卵母细胞成熟评价
卵丘细胞包围卵母细胞，通过缝隙连接为卵母细胞提供营养和代谢支持，卵丘扩展程度与卵母细胞成熟质量密切相关。本研究在成熟培养前后采集COCs图像，利用体视显微镜和 ImageJ 软件测量卵丘面积变化，以最终面积与初始面积比值计算扩展率，同时统计第一极体排出率评估成熟率。结果显示，DOEC-EVs处理组卵丘扩展程度显著增加，成熟率显著提高，扩展相关基因 HAS2、PTX3 和 PTGS2 的 mRNA 表达水平显著升高。这些数据将囊泡处理与卵母细胞成熟事件关联，构成药效评价的第一层证据。
卵丘细胞增殖、周期与凋亡分析
卵丘细胞的数量和状态直接影响其对卵母细胞的支持能力。本研究以CCK-8法在酶标仪 450 nm 处测定不同浓度囊泡处理后的细胞增殖能力，确定 1 × 10⁷/mL 为最佳工作浓度。EdU 染色结合荧光显微镜观察DNA合成期细胞比例，结果显示囊泡处理组EdU阳性细胞比例显著增加。流式细胞术检测细胞周期分布，发现G1期细胞比例下降、S期细胞比例上升，CDK4 和 CDK6 mRNA表达水平升高。凋亡检测采用Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术，囊泡处理组凋亡细胞比例显著降低，caspase-9 和 BAX mRNA水平下降，BCL-2 mRNA水平升高，caspase-9 蛋白表达水平经蛋白质印迹验证与RNA结果一致。该环节说明DOEC-EVs通过调控细胞周期进程和抑制凋亡维持卵丘细胞存活与增殖，为卵母细胞提供更有利的微环境。
氧化应激与线粒体功能检测
体外培养环境中的氧化应激是导致卵母细胞质量下降的重要因素。本研究以DCFH-DA探针和CM-H₂DCFDA探针分别标记卵母细胞和卵丘细胞，在荧光显微镜下采集图像并以 ImageJ 定量荧光强度，评估ROS水平；以GSH探针检测还原型谷胱甘肽水平；以JC-1染料评估线粒体膜电位，通过红绿荧光比值反映线粒体功能状态。同时，以免疫荧光染色检测线粒体外膜转运蛋白TOM20的表达，以ATP检测试剂盒测定细胞内ATP含量，以实时荧光定量PCR检测SOD1、CAT、TFAM、ATP5F1A 和 ATP5PD 等基因表达。结果显示，囊泡处理组卵丘细胞和卵母细胞的ROS水平显著降低，GSH水平、TOM20荧光强度、JC-1红绿比值、ATP含量及抗氧化和线粒体相关基因表达均显著升高。该环节以荧光显微成像和代谢检测技术为核心，从氧化还原平衡和能量代谢两个维度评价DOEC-EVs对细胞功能的保护作用。
糖酵解代谢分析
卵母细胞缺乏直接利用葡萄糖的酶系，其能量供应依赖卵丘细胞通过糖酵解将葡萄糖转化为丙酮酸和乳酸，再经缝隙连接转运至卵母细胞。本研究设置单独培养卵丘细胞和卵丘细胞与卵母细胞共培养两种条件，在囊泡处理后检测培养液中丙酮酸消耗量和乳酸产生量，以酶标仪在 25°C 下完成代谢物测定。同时以实时荧光定量PCR检测糖酵解相关基因表达。结果显示，囊泡处理组丙酮酸消耗和乳酸产生均增加，共培养条件下 PKM 和 LDHA 表达显著升高，SLC2A1 和 ENO1 在两种条件下均升高。该环节表明DOEC-EVs增强了卵丘细胞的糖酵解活性，共培养体系中卵母细胞对卵丘细胞代谢的支持作用更为明显。
孤雌胚胎发育评价
卵母细胞成熟质量的最终验证需通过后续胚胎发育能力来体现。本研究将成熟后的卵母细胞以 0.4% 透明质酸酶去除卵丘细胞，以BTX ECM 2001电穿孔仪在 160 V、10 ms 条件下进行激活，随后以细胞松弛素B处理抑制第二极体排出，获得二倍体孤雌胚胎，在BO-IVC培养基中培养至囊胚阶段。第 7 天统计卵裂率和囊胚率，以Hoechst 33342 染色结合荧光显微镜计数囊胚细胞数。结果显示，DOEC-EVs处理组卵裂率和囊胚率显著提高，囊胚细胞数显著增加。该环节将成熟阶段的囊泡干预与胚胎发育终点连接，完成了从卵丘细胞功能改善到卵母细胞发育能力提升的证据闭环。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 表征验证 | 纳米颗粒跟踪分析、透射电镜、蛋白质印迹 | 三者分别从粒径分布、形态特征和蛋白标志物层面确认囊泡身份，相互补充 |
| 定位与功能关联 | 共聚焦显微镜、流式细胞术、代谢检测 | 共聚焦确定囊泡作用靶细胞为卵丘细胞，流式细胞术和代谢检测在靶细胞内定量功能变化 |
| 功能互补 | 荧光显微成像、酶标仪、实时荧光定量 PCR | 荧光成像提供原位氧化还原和线粒体状态信息，酶标仪提供ATP和代谢物定量，qPCR提供基因表达层面证据 |
| 终点验证 | 电穿孔仪、体外培养体系、荧光显微镜 | 电穿孔激活后的胚胎发育数据验证卵母细胞成熟质量改善的生物学意义 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 确认囊泡被靶细胞摄取并定位 | 荧光标记 + 共聚焦显微镜 | 区分囊泡进入卵丘细胞与卵母细胞，明确后续功能检测的细胞对象 |
| 评价卵丘细胞增殖与凋亡 | CCK-8 + EdU 染色 + 流式细胞术 + 蛋白质印迹 | 从活力、DNA合成、凋亡率和凋亡相关蛋白水平多层次验证细胞状态 |
| 评价卵丘细胞和卵母细胞氧化还原与线粒体功能 | ROS/GSH 荧光探针 + JC-1 染色 + 免疫荧光 + ATP 检测 + 实时荧光定量 PCR | 从氧化应激、膜电位、ATP含量和基因表达多个维度反映线粒体功能状态 |
| 评价糖酵解代谢活性 | 丙酮酸和乳酸代谢物检测 + 实时荧光定量 PCR | 结合代谢物消耗/产生量和糖酵解基因表达，反映卵丘细胞对卵母细胞的代谢支持能力 |
| 验证卵母细胞后续发育能力 | 电穿孔仪 + 体外胚胎培养 + Hoechst 染色 + 荧光显微镜 | 以卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数作为终点指标，验证成熟阶段干预的发育效应 |
在类似研究中，如果研究目标是评价细胞外囊泡或可溶性因子对卵母细胞体外成熟的促进作用，上述仪器组合可以作为参考框架。需要注意的是，不同物种卵丘-卵母细胞复合体的囊泡摄取行为可能不同，共聚焦定位实验应在正式功能评价前完成。流式细胞术检测凋亡和细胞周期时，需要看样品制备过程中消化和固定条件是否适合目标细胞类型。代谢物检测的适用前提是培养基更换时机和细胞密度保持一致，否则丙酮酸消耗和乳酸产生量的组间比较可能受到干扰。孤雌胚胎发育评价适合作为终点验证，但孤雌激活效率本身受物种和激活参数影响，需要结合卵母细胞成熟率综合判断。
文献信息
Hu B, Shi SM, Yu XF, et al. The effects of sika deer oviduct epithelial cell-derived extracellular vesicles on oocytes and parthenogenetic embryos. Biol Reprod, 2025, 112(6): 1148–1166. PMID: 40068303. DOI: 10.1093/biolre/ioaf048.