青蒿素部分耐药已在非洲多个地区出现并扩散，KAF156（ganaplacide）与苯芴醇（lumefantrine，LUM）组合被视为可能替代现有一线青蒿素联合疗法（ACT）的候选方案。该研究需要回答两个药效问题：KAF156 单独或与 LUM 联用是否与青蒿素有交叉耐药风险；以及在青蒿素耐药虫株进入静止期后，KAF156 与 LUM 是否仍能阻止复燃。研究以携带不同 pfk13 突变及其他抗疟药耐药标志的恶性疟原虫虫株为对象，用 SYBR Green I 化学敏感性试验获得 IC50，用环期存活试验（RSA）确认青蒿素耐药表型，用复燃试验比较耐药与敏感虫株在 48 h 药物暴露后的恢复能力，用静止期存活试验（QSA）评估药物对青蒿素诱导的静止期虫体的活性，并以 Sanger 测序和 qPCR 完成耐药相关基因分型，形成基因型—表型—药效的对应关系。
上述方法各自回答不同的药效问题，不能相互替代：化学敏感性试验反映增殖期总体敏感性，RSA 区分青蒿素耐药与敏感表型，复燃试验用于判断交叉耐药，QSA 则专门评估静止期虫体是否被清除。基因分型结果与药效数据并列分析，用于判断 KAF156 活性是否受已知耐药突变影响。培养气体条件（富集条件与基础条件）在部分长期试验中对结果有影响，是解读数据时需要考虑的变量。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 虫株培养与气体条件设置 | 富集条件（5% O2、5% CO2、90% N2）与基础条件（5% CO2）培养 | 维持不同虫株生长并比较气体条件对药效读数的影响 | 培养条件记录、后续各试验的基础数据 |
| 耐药相关基因分型 | PCR、Sanger 测序、qPCR（CFX Real Time PCR 仪，SsoFast EvaGreen Supermix） | 确认 pfk13、pfcrt、pfmdr1、pfmdr2、pfdhps、pfdhfr、pfcytb、pfact、pfcarl、pfugt 基因状态及 pfmdr1 拷贝数 | 基因突变谱、pfmdr1 相对拷贝数 |
| 增殖期敏感性评价 | SYBR Green I 化学敏感性试验、VICTOR Nivo 酶标仪（485 nm 激发/528 nm 发射） | 测定各药物对增殖期寄生虫的 IC50 | DHA、ATQ、CQ、LUM、KAF156 的 IC50 值 |
| 青蒿素耐药表型确认 | RSA0–3h、显微镜计数 | 验证虫株是否符合青蒿素耐药标准 | DHA 处理后的存活率 |
| 交叉耐药风险评估 | 复燃试验（48 h 药物暴露后撤药观察） | 比较耐药与敏感虫株在药物暴露后的恢复能力 | 复燃天数、Kaplan–Meier 生存曲线 |
| 静止期药效评价 | QSA（DHA 诱导静止期后加药 48 h） | 判断药物能否清除青蒿素诱导的静止期虫体 | 复燃天数、生存曲线、与 DHA/DHA 对照的延迟比较 |
关键环节
基因分型环节决定了后续药效数据能否与耐药背景对应。研究用 DreamTaq Hot Start DNA 聚合酶扩增目标基因，Sanger 测序由 Genoscreen 公司完成，序列与 3D7 参考基因组在 MEGA 11 软件中比对；pfmdr1 基因扩增则用 CFX Real Time PCR 仪配合 SsoFast EvaGreen Supermix 进行 qPCR，以 pfβtubulin beta chain 为对照基因计算相对拷贝数。该环节产生的基因型数据是表 1 和表 2 的组成部分，用于后续判断 KAF156 活性是否受 pfk13、pfcrt、pfmdr1 等突变或 pfmdr1 扩增影响。
增殖期药效评价以 SYBR Green I 化学敏感性试验为核心。环期寄生虫经 5% D-山梨醇同步并调整至 1% 疟色素原血症后，在 96 孔板中暴露于不同浓度药物 48 h，每个浓度做三复孔，荧光在 VICTOR Nivo 酶标仪上以 485 nm 激发/528 nm 发射读取，IC50 用 GraphPad Prism 7 计算。该环节给出的 IC50 显示，DHA 的 IC50 在 1.6～2.9 nM 之间，无法区分青蒿素耐药与敏感虫株；KAF156 的 IC50 为 3～11 nM，与既往报道的敏感虫株范围一致，且未因 pfk13、pfcrt、pfmdr1、pfmdr2、pfdhps、pfdhfr 突变或 pfmdr1 扩增而升高。LUM 的 IC50 在 14～89 nM 之间，携带 pfmdr1 N86Y 的 SMT010 与 SMT010 P413A 虫株 IC50 最低，而携带 pfmdr1 扩增的 IPC8461 未见 IC50 差异。
RSA0–3h 用于确认青蒿素耐药表型。入侵后 0～3 h 的环期寄生虫经 Percoll-山梨醇处理后调整至 0.5% 疟色素原血症，暴露于 700 nM DHA 或 0.1% DMSO 6 h，双复孔，洗涤后在不含药条件下培养 66 h，由两名独立显微镜检者各计数 10 000 个红细胞中的疟色素原血症，计算存活率。结果显示，所有青蒿素敏感虫株存活率低于 1%，耐药虫株为 3.1%～31.4%，符合 WHO 对青蒿素耐药的判定标准。该环节是复燃试验和 QSA 选取虫株的依据，也使化学敏感性试验无法区分的耐药表型得到独立确认。
复燃试验用于评估交叉耐药风险。虫株经 5% D-山梨醇同步、调整至 3% 疟色素原血症和 2% 血细胞比容后，在 6 孔板中接受药物处理 48 h，随后撤药并置于无药培养条件，通过血涂片追踪疟色素原血症直至培养恢复至起始水平，定义为复燃日；30 天未复燃则删失。数据以 Kaplan–Meier 生存曲线分析，log-rank（Mantel–Cox）检验比较差异。在 DHA 700 nM 处理下，青蒿素耐药虫株均比敏感虫株更快复燃；KAF156 单药、LUM 单药及 KAF156 + LUM 组合在多数虫株和培养条件下未见交叉耐药，仅 3D7 crtl 和 SMT010 在 KAF156 + LUM 暴露后延迟复燃。该环节的数据支持组合对增殖期青蒿素耐药虫株具有增效杀灭作用，但作者也指出 F32 虫株在基础条件下 KAF156 单药出现复燃延迟差异，不能完全排除 ART 与 KAF156 之间存在轻微交叉耐药的可能。
QSA 用于评估药物对青蒿素诱导静止期虫体的活性。环期寄生虫经 5% D-山梨醇同步、调整至 3% 疟色素原血症和 2% 血细胞比容后，先暴露于 700 nM DHA 6 h 诱导静止期，随后在持续 DHA 存在条件下加入待测药物处理 48 h；同时设置仅 DHA 的对照条件和未经 DHA 处理直接加药的条件，分别用于判断对静止期和增殖期虫体的活性。撤药后追踪复燃至 30 天，以 Kaplan–Meier 曲线和 log-rank 检验分析。以 CQ 为阴性对照、ATQ 为阳性对照，结果验证了 CQ 对静止期虫体活性丧失而 ATQ 保持有效；KAF156、LUM 及 KAF156 + LUM 在所有耐药虫株和培养条件下均导致复燃延迟或无复燃，且该活性不受 pfmdr1 扩增或 pfcrt、pfmdr1、pfmdr2、pfdhps、pfdhfr 突变影响。IPC6610 因 RSA0–3h 存活率高但 DHA 单药复燃极晚，被排除在合并分析之外。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 表型确认 | RSA 与 SYBR Green I 化学敏感性试验 | 化学敏感性试验不能区分青蒿素耐药与敏感虫株，RSA 提供独立表型判定，两者互补 |
| 机制延伸 | 复燃试验与 QSA | 复燃试验评估 48 h 暴露后的恢复能力，QSA 进一步模拟 ACT 治疗中先接触青蒿素再接触伴侣药的场景，评估静止期虫体是否被清除 |
| 基因型—表型关联 | Sanger 测序、qPCR 与各药效试验 | 基因分型结果与 IC50、复燃天数并列分析，用于判断药效是否受已知耐药突变或 pfmdr1 扩增影响 |
| 对照验证 | CQ 与 ATQ 在 QSA 中的对照作用 | CQ 作为阴性对照、ATQ 作为阳性对照，验证 QSA 能区分对静止期虫体有无活性的药物 |
更稳妥的理解是，这些方法构成一条由基因型到表型再到药效的递进证据链：基因分型给出耐药背景，化学敏感性试验给出增殖期敏感性，RSA 确认青蒿素耐药表型，复燃试验判断交叉耐药，QSA 判断静止期清除能力。任一环节单独使用都不足以支撑 KAF156 + LUM 在青蒿素耐药背景下的药效结论。
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 评估候选药物是否受已知耐药突变影响 | PCR + Sanger 测序 + qPCR 基因分型，配合 SYBR Green I 化学敏感性试验 | 将基因型与 IC50 并列，判断药效是否与特定突变或基因扩增相关 |
| 确认青蒿素耐药表型并评估交叉耐药 | RSA0–3h + 复燃试验 | RSA 提供耐药表型判定，复燃试验比较耐药与敏感虫株在药物暴露后的恢复能力 |
| 评估药物对静止期虫体的清除能力 | QSA，配合 CQ 阴性对照和 ATQ 阳性对照 | 模拟 ACT 治疗中青蒿素先暴露的场景，判断伴侣药能否阻止静止期虫体复燃 |
| 比较培养条件对长期药效读数的影响 | 富集条件与基础条件并行培养，配合复燃试验和 QSA | 识别气体条件在长期实验中对复燃时间的影响，避免将培养差异误读为药效差异 |
对实验人员来说，若研究目标是评估新药或联用方案在青蒿素耐药背景下的药效，可优先考虑「基因分型 + 化学敏感性试验 + RSA + 复燃试验 + QSA」的组合。前提是虫株需覆盖不同 pfk13 突变及其他耐药标志，且药物浓度尽量接近药理学相关浓度。需要注意的是，化学敏感性试验的 IC50 不能替代 RSA 和 QSA 的表型判断；复燃试验和 QSA 的长期观察对培养条件敏感，培养气体条件和血清批次都可能影响读数，解释数据时需要结合具体条件。该组合主要适用于体外药效评价，不能直接外推至体内药效或临床结局。
文献信息
Manaranche J, Laurent M, Tressieres R, et al. In vitro evaluation of ganaplacide/lumefantrine combination against Plasmodium falciparum in a context of artemisinin resistance. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2024. PMID: 39206510. DOI: 10.1093/jac/dkae300.