银屑病以角质形成细胞异常增殖与分化、表皮增厚和炎症细胞浸润为主要病理特征，其分子基础之一是信号转导通路的异常激活，经典 Wnt/β-catenin 通路在其中参与调控角质形成细胞增殖与分化。黄连解毒汤（HLJDD）为多成分、多靶点的中药方剂，临床应用中对银屑病有较好疗效，但其作用于该通路的具体环节尚不清楚。本研究以咪喹莫特（IMQ）诱导 SKH-1 裸鼠建立银屑病模型并给予不同剂量黄连解毒汤灌胃，通过 HE 染色评价病理形态与表皮厚度，通过免疫组化检测并半定量 Wnt1、β-catenin、c-Myc，通过 Western blot 检测 Wnt 受体 Frizzled-2、LRP5/6，降解复合体 GSK-3β、APC、Axin2，以及下游靶蛋白 TCF4、LEF1、cyclin D1、TBX3、EPHB2 和 NOTUM 酶。三种技术分别承担形态学确证、原位定位与半定量、以及通路多环节蛋白定量，共同构成从表型到分子机制的证据链。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 模型建立与给药 | 5% 咪喹莫特外涂，黄连解毒汤灌胃，QD 阳性对照 | 在 SKH-1 裸鼠中复制银屑病样皮损并评价药效 | 背部皮肤红斑、鳞屑、皮损及结痂的大体表型记录 |
| 组织取材与切片 | 石蜡包埋，石蜡切片机（RM2135）切片至 5 μm | 获得可用于染色与成像的皮肤组织切片 | 组织切片 |
| 病理形态评价 | HE 染色，光学显微镜（ECLIPSE Ci-L）观察 | 确认表皮增厚、角化过度与炎症细胞浸润，判断药效 | 10× 与 40× 病理图像 |
| 通路蛋白原位检测 | 免疫组化，抗 Wnt1、β-catenin、c-Myc 一抗，DAB 显色，荧光显微镜（BX53）成像 | 定位通路关键蛋白在组织中的表达分布并半定量阳性细胞 | 免疫组化图像与阳性细胞百分比 |
| 通路多环节蛋白定量 | Western blot，10% 分离胶与 5% 浓缩胶，PVDF 电转，ECL 显色，β-actin 内参 | 定量受体、降解复合体与下游靶蛋白的表达变化 | 各目标蛋白相对表达量（条带灰度） |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9.0.0，t 检验或单因素方差分析 | 比较组间差异是否具有统计学意义 | 均值 ± 标准差及 P 值 |
关键环节
模型建立与药效确证是整条证据链的起点。实验以 5% 咪喹莫特每日外涂 13 天诱导 SKH-1 裸鼠银屑病样皮损，黄连解毒汤灌胃自第 7 天开始持续 7 天，并设 QD 阳性对照组。外涂约 6 天后小鼠背部出现红斑、鳞屑、皮损或结痂，对照组皮肤外观正常，IMQ 组炎症程度持续加重；给药 7 天后，黄连解毒汤组小鼠背部皮损宏观表现明显改善，红斑、鳞屑及皮损减少。这一环节产出的外观与皮损记录，为后续组织学与分子检测提供药效前提，也确定了剂量分组与取材时间点。
HE 染色承担病理形态的确认与药效的病理学判读。皮肤样本经 4% 多聚甲醛固定、石蜡包埋，用石蜡切片机切为 5 μm，脱蜡后行 HE 染色并在光学显微镜下观察。结果显示正常小鼠表皮仅含约三层细胞且较薄，IMQ 处理后表皮厚度增加，出现角质层存在细胞核等棘层肥厚特征，并伴炎症细胞浸润；黄连解毒汤处理后表皮增厚程度下降，IMQ 诱导的炎症细胞浸润受到抑制，尤以高浓度组改善明显。该结果将宏观皮损改善与组织学变化对应起来，是通路蛋白检测的组织学依据。
免疫组化用于 Wnt1、β-catenin、c-Myc 的原位定位与半定量。切片脱蜡水化后经 3% 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，5% 山羊血清封闭，与 Wnt1（1∶100）、c-Myc（1∶100）、β-catenin（1∶100）一抗 4 ℃ 孵育过夜，再经二抗孵育与 DAB 显色、苏木素复染，于 BX53 荧光显微镜下采集图像。结果显示对照组三种蛋白表达均较低，IMQ 诱导后胞质表达明显上调，提示通路被激活；黄连解毒汤处理后 Wnt1 阳性细胞数量呈剂量依赖性下降，β-catenin 与 c-Myc 也相应下降，高剂量组下调程度与阳性药 QD 组接近。该数据说明黄连解毒汤对通路具有抑制效果，并明确了蛋白在组织中的表达部位。
Western blot 用于在通路多个环节上定量蛋白表达。皮肤样本在冰上剪碎后超声匀浆 20 秒，RIPA 裂解 20 分钟，12 000 rpm 4 ℃ 离心 10 分钟，BCA 法测定总蛋白；以 10% 分离胶与 5% 浓缩胶行 SDS-PAGE，电转至 PVDF 膜，5% BSA 室温封闭 1 小时，一抗 4 ℃ 孵育过夜，HRP 标记二抗（1∶2000）孵育，β-actin（1∶1000）为内参，ECL 底物显色检测。受体方面，Frizzled-2、LRP6、LRP5 在 IMQ 处理后均显著下降（说明 IMQ 对 Wnt 受体蛋白具有激活作用），黄连解毒汤灌胃使 Frizzled-2 与 LRP6 呈剂量依赖性下降，LRP5 下降不显著，提示其主要作用于 Frizzled-2 与 LRP6。降解复合体方面，GSK-3β、APC、Axin2 被 IMQ 抑制，黄连解毒汤处理后三者表达均回升。两组结果共同支持黄连解毒汤同时干预 Wnt 受体与降解复合体两个环节。
下游靶基因检测进一步覆盖核内转录与效应环节。Western blot 检测显示 TCF4、LEF1、cyclin D1 在 IMQ 刺激后显著升高，黄连解毒汤处理后呈剂量依赖性下降；TBX3 与 EPHB2 虽未被 IMQ、黄连解毒汤与 QD 显著调控，但在 IMQ 后升高，黄连解毒汤处理后也呈下降趋势；NOTUM 在 IMQ 作用后反馈性上调，黄连解毒汤处理后剂量依赖性降低。五个靶基因受 IMQ 与黄连解毒汤影响的幅度不同，但总体趋势相似，提示黄连解毒汤可能通过抑制核内因子而影响下游靶基因表达。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程承接 | 石蜡切片机、HE 染色、光学显微镜 | 先以 HE 染色建立表皮增厚与炎症浸润的病理基线，为后续蛋白检测提供组织学判读依据 |
| 定位与半定量互补 | 免疫组化、BX53 荧光显微镜 | 在组织原位显示 Wnt1、β-catenin、c-Myc 的分布并给出阳性细胞百分比，与 Western blot 的总蛋白定量互为补充 |
| 层级验证 | 免疫组化与 Western blot | 免疫组化提示 β-catenin 表达下降，Western blot 显示降解复合体 GSK-3β、APC、Axin2 回升，两者结合支持 β-catenin 降解增强的解释 |
| 环节覆盖 | Western blot 多抗体检测 | 在同一检测平台上覆盖受体、降解复合体与下游靶蛋白，形成通路多环节的定量证据 |
| 干预对照 | 黄连解毒汤剂量组与 QD 阳性对照组 | 通过阳性药对照判断黄连解毒汤高剂量组的效应强度，并对不同剂量作剂量依赖性分析 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 先确认模型与药效再进入机制检测 | 石蜡切片机、HE 染色、光学显微镜 | 在蛋白检测前获得表皮厚度与炎症浸润的组织学证据，避免仅凭大体表型判断药效 |
| 判断通路关键蛋白的组织分布与表达水平 | 免疫组化、DAB 显色、荧光显微镜成像 | 保留组织空间信息，可观察蛋白在胞质或胞核的表达变化并作阳性细胞半定量 |
| 覆盖通路多个环节的蛋白定量 | 超声匀浆、BCA 蛋白定量、SDS-PAGE、PVDF 电转、ECL 成像 | 在同一平台检测受体、降解复合体与下游靶蛋白，便于比较不同环节的变化方向 |
| 判断中药多成分对通路的作用层次 | 剂量分组结合免疫组化与 Western blot | 通过剂量依赖性变化与阳性药对照，推断作用环节是在膜受体、胞质降解复合体还是核内转录水平 |
对实验人员来说，该组合的前提是具备可重复的动物模型与稳定的取材、固定流程；HE 染色与免疫组化对组织固定和切片质量敏感，Western blot 则依赖充分的蛋白提取与内参一致性。若研究目标是判断某一干预是否作用于通路，更稳妥的做法是先以 HE 染色确认表型，再以免疫组化定位关键节点，最后用 Western blot 定量受体、降解复合体与下游靶蛋白，而不是仅依赖单一检测层次得出结论。需要注意，免疫组化的阳性细胞百分比属于半定量，与 Western blot 的总蛋白相对量并不能直接换算；LRP5 在本研究中未见显著下降，也提示不同受体亚型对同一干预的响应并不一致，判断时需看具体分子而非笼统归为「通路被抑制」。
文献信息
Yang X, Luo G, Fu L, et al. Intervention Mechanism of Hunag-Lian Jie-Du Decoction on Canonical Wnt/β-Catenin Signaling Pathway in Psoriasis Mouse Model. Evid Based Complement Alternat Med, 2022-04-14. PMID: 35463060. DOI: 10.1155/2022/3193572.