冷暴露条件下 BAT 的持续产热依赖神经与体液信号的动态整合，但 NE 水平在冷暴露数小时后明显下降，而 BAT 产热基因与 β-肾上腺素信号仍持续增强，提示存在替代性激活机制。该研究以小鼠冷暴露模型为基础，联合血浆蛋白质组学、基因过表达与敲除、重组蛋白处理、RNA-seq、代谢笼监测和 CUT&Tag，逐步锁定 eWAT 来源的分泌因子 sST2，并证明其通过直接结合 BAT 中的 ADRB3、经 CREB1 转录上调后维持 UCP1 依赖的产热，且与 ADRB3 激动剂具有协同作用。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 冷暴露时间序列与 BAT 去神经模型 | 恒温冷室、红外热像仪、直肠温度计、ELISA、免疫印迹、qPCR | 确定 BAT 中 NE 水平下降后产热仍持续，并区分神经与体液机制 | BAT 与血浆 NE 水平、ADRB3 免疫沉淀 NE 结合量、核心体温与体表温度、UCP1 与产热基因表达、PKA 底物与 HSL 磷酸化 |
| 血浆蛋白质组学筛选分泌因子 | LC-MS/MS、高丰度蛋白去除柱与磁珠、分泌蛋白数据库注释 | 在 BAT 去神经冷暴露血浆中无偏鉴定候选分泌因子 | 血浆蛋白质组差异谱、候选分泌因子列表（Ngp、sST2、Cgref1、Orm2） |
| 候选因子功能筛选与重组蛋白验证 | 原代棕色前脂肪细胞过表达、BAC 与人 SAT 外植体培养、免疫印迹 | 确认哪个候选因子直接激活 β-肾上腺素信号 | PKA 底物与 HSL 磷酸化水平 |
| sST2 来源与诱导条件解析 | 组织 qPCR、eWAT 切除、ISO 与 β-AR 激动/拮抗处理、ELISA | 确定 sST2 的组织来源、冷诱导时间曲线及 β-AR 亚型依赖 | 组织 sST2 表达谱、血浆 sST2 水平、Adrb1/2/3 过表达与抑制剂处理后的 sST2 表达 |
| CREB1 转录调控验证 | CUT&Tag、荧光素酶报告基因、定点突变、Creb1 过表达与敲低 | 确定 CREB1 是否直接结合 sST2 启动子并驱动转录 | CREB1 在 sST2 启动子区的富集峰、荧光素酶活性、突变体活性变化、sST2 mRNA 与分泌量 |
| sST2-KO 小鼠表型与代谢分析 | CRISPR/Cas9 基因编辑、代谢笼、RNA-seq、透射电镜、H&E 染色 | 确定 sST2 缺失是否损害冷暴露下 BAT 持续产热 | 生存曲线、核心体温、能量消耗与摄氧量、BAT 线粒体超微结构、差异表达基因与 GSEA 通路 |
| IL33 非依赖性与受体结合验证 | IL33-KO 与 sST2/IL33 DKO 小鼠、共免疫沉淀、免疫荧光、CL316,243 回补 | 判断 sST2 是否经 IL33 非依赖途径直接结合 β-AR | 血浆 IL33 水平、DKO 冷敏感表型、sST2 与 ADRB1/2/3 共沉淀与共定位、ADRB3 激动剂回补后的产热恢复 |
| sST2 过表达与 ADRB3 激动剂协同 | AAV9 尾静脉注射、冷暴露、人 SAT 外植体、OCR 测定、MitoTracker 与油红 O 染色 | 评估 sST2 是否促进米色脂肪形成并与 ADRB3 激动剂协同 | 核心体温与生存曲线、iWAT 产热基因与蛋白、线粒体质量与耗氧率、人 SAT 外植体 UCP1 表达 |
关键环节
BAT 去神经模型区分神经与体液机制
冷暴露初期 BAT 内 NE 迅速升高，2 h 后明显下降，而血浆 NE 保持稳定，BAT 产热基因与 PKA 底物、HSL 磷酸化仍持续上升。为判断 NE 下降后是否存在替代激活途径，研究采用手术切断 BAT 交感神经，并以 10 ℃ 温和冷暴露进行验证。结果显示，去神经小鼠在 4 ℃ 最初 4 h 出现明显低体温，说明 NE 对快速产热不可替代；但在 10 ℃ 下，去神经小鼠仍能维持核心体温并诱导 Ucp1、Dio2、Pgc1α、Elovl3 及 PKA 底物、HSL 磷酸化。该环节通过红外热像与直肠温度计区分表面与核心温度，结合免疫印迹与 qPCR，支持 NE 非依赖的体液机制参与 BAT 持续激活。
血浆蛋白质组学鉴定 sST2 为候选分泌因子
为无偏寻找冷暴露下 BAT 去神经小鼠血浆中升高的分泌因子，研究采用柱式与磁珠两种高丰度蛋白去除方法处理血浆，并以 LC-MS/MS 进行蛋白质组学分析，再与已知分泌蛋白数据库比对。结果鉴定出 Ngp、sST2、Cgref1、Orm2 四个冷暴露下富集的候选分泌因子。随后在原代棕色前脂肪细胞中逐一过表达并诱导分化为成熟 BAC，以 NE 刺激后 PKA 底物与 HSL 磷酸化为读出，仅 sST2 过表达增强 β-肾上腺素信号。重组 sST2 蛋白处理小鼠 BAC 与人皮下脂肪外植体同样直接激活 PKA 与 HSL 磷酸化。血浆蛋白质组学在此承担候选发现功能，后续过表达与重组蛋白实验则完成功能筛选，两者共同构成从无偏筛选到候选锁定的证据链。
sST2 的组织来源与 β-AR 亚型依赖
组织表达谱显示 sST2 在 eWAT 中表达水平相对突出，切除 eWAT 后血浆 sST2 明显下降。冷暴露、慢性冷暴露与 ISO 处理均诱导 eWAT 而非 BAT 中 sST2 表达，BAT 去神经亦升高 eWAT sST2。在细胞层面，人内脏脂肪来源成熟脂肪细胞的 sST2 表达高于 SVF，ISO 可直接上调 C3H10T1/2 白色脂肪细胞 sST2 表达与分泌。为明确 β-AR 亚型，研究比较 ISO 与选择性 ADRB3 激动剂 CL316,243 的作用，并采用 ADRB1 抑制剂 nebivolol、ADRB2 抑制剂 zenidolol 及 Adrb1/2/3 过表达。结果提示 ADRB1 与 ADRB2 介导 sST2 诱导，而 ADRB3 不承担该功能。该环节将分泌因子的来源与上游神经信号连接，为后续 WAT—BAT 通讯提供组织学依据。
CREB1 直接结合 sST2 启动子并驱动转录
β-肾上腺素信号下游转录因子 CREB1 是候选调控节点。研究在 C3H10T1/2 细胞中过表达 Creb1、使用 CREB1 抑制剂 Compound 3i 以及敲低 Creb1，观察到 sST2 表达与分泌随之升高或降低。为验证直接结合，研究对 NE 或溶剂处理的成熟脂肪细胞进行 CUT&Tag，使用抗磷酸化 CREB1 抗体，在 sST2 转录起始位点上游 –3.45 kb 至 –3.40 kb 区域检测到显著富集，NE 处理进一步增强结合。荧光素酶报告基因与 JASPAR 预测、定点突变实验显示，–3445 bp 至 –3437 bp 与 –3422 bp 至 –3414 bp 两个位点的突变显著降低荧光素酶活性。CUT&Tag 在此提供全基因组范围内的结合定位，荧光素酶与突变则完成功能验证，两者互补确认 CREB1 对 sST2 的转录调控。
sST2-KO 小鼠验证持续产热需求
为排除 ST2L 的混杂效应，研究采用 CRISPR/Cas9 删除 Il1rl1 基因第 8～9 内含子，特异性去除可溶性 sST2 而保留 ST2L。sST2-KO 小鼠血浆 sST2 显著降低，eWAT 中 sST2 表达下降而 ST2L 不变。在 BAT 去神经并 10 ℃ 冷暴露条件下，sST2-KO 小鼠出现明显低体温，BAT 变白、脂滴积累、线粒体肿胀与嵴结构破坏，代谢笼显示摄氧量与能量消耗降低，而摄食与活动不变。RNA-seq 发现 684 个基因上调、670 个基因下调，GSEA 显示下调基因主要富集于产热相关通路；qPCR 与免疫印迹进一步确认产热基因表达及 PKA 底物、HSL 磷酸化降低。该环节通过基因编辑、代谢笼与 RNA-seq 形成表型—转录组—信号通路的证据链，支持 sST2 是 NE 下降后维持 BAT 产热所必需。
IL33 非依赖性与 ADRB3 直接结合
sST2 传统上被视为 IL33 诱饵受体，但 sST2-KO 小鼠血浆 IL33 水平未显著改变。研究进一步构建 sST2/IL33 双敲除小鼠，在 BAT 去神经冷暴露下，DKO 小鼠表现出与 sST2 单敲除相似的低体温、BAT 变白与产热基因抑制，而 IL33 单敲除对照未出现同等程度损害。共免疫沉淀显示 sST2 与 ADRB1、ADRB2、ADRB3 均有相互作用，其中与 ADRB3 结合较强、与 ADRB1 较弱；免疫荧光在 HEK293T 细胞中观察到 sST2 与 β-AR 在细胞膜共定位。选择性 ADRB3 激动剂 CL316,243 可显著改善 DKO 小鼠冷不耐受并恢复产热基因与肾上腺素信号。该环节以双敲除遗传模型和蛋白互作实验将 sST2 的作用机制从 IL33 轴分离，并指向 ADRB3 直接结合。
sST2 过表达与 ADRB3 激动剂协同
为评估转化潜力，研究通过 AAV9 尾静脉注射在 WT 与 IL33-KO 小鼠中过表达 sST2，随后进行 4 ℃ 冷暴露。sST2 过表达提高 IL33-KO 小鼠核心体温与冷耐受，BAT 变棕、产热基因与 β-肾上腺素信号增强，血浆 NEFA 升高、TG 降低；在 WT 背景下，因 NE 驱动的 BAT 激活已较强，sST2 过表达对 BAT 的影响相对有限，但 iWAT 米色化在两种遗传背景下均显著增强。细胞实验中，sST2 条件培养基促进 C3H10T1/2 与 BAC 产热基因表达、增加线粒体质量与耗氧率。在鼠源 iWAT 与人皮下脂肪外植体中，sST2 与 CL316,243 或 mirabegron 联用可协同上调产热基因，提示 sST2 可作为 ADRB3 激动剂的增效手段。心脏超声与心力衰竭标志物检测未发现 sST2 过表达对小鼠心脏功能的明显损害。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 候选发现与功能筛选 | LC-MS/MS 血浆蛋白质组学、原代棕色前脂肪细胞过表达、重组蛋白处理 | 蛋白质组学提供无偏候选列表，过表达与重组蛋白实验逐一验证哪个因子直接激活 β-肾上腺素信号 |
| 上游诱导与下游转录 | β-AR 亚型药理学与过表达、CUT&Tag、荧光素酶报告基因 | 药理学确定 ADRB1/2 介导 sST2 诱导，CUT&Tag 定位 CREB1 结合区，荧光素酶与突变验证启动子功能 |
| 遗传缺失与表型验证 | sST2-KO、IL33-KO、sST2/IL33 DKO 小鼠、代谢笼、RNA-seq | 条件性基因敲除排除 ST2L 混杂，双敲除分离 IL33 轴，代谢笼与 RNA-seq 从整体代谢与转录组层面确认产热损害 |
| 受体结合与回补验证 | 共免疫沉淀、免疫荧光、ADRB3 激动剂回补 | 蛋白互作与共定位支持 sST2 直接结合 ADRB3，激动剂回补实验证明 β-AR 激活是表型恢复的关键节点 |
| 过表达与协同评估 | AAV9 过表达、人脂肪外植体、OCR 测定、MitoTracker 与油红 O 染色 | AAV9 在体验证 sST2 的冷耐受与米色化效应，外植体与细胞实验评估与 ADRB3 激动剂的协同作用 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 筛选组织间通讯的分泌因子 | 血浆蛋白质组学（高丰度蛋白去除联合 LC-MS/MS）＋候选因子过表达＋重组蛋白功能验证 | 适用于从体液样本无偏发现候选配体，再以细胞水平信号读出锁定功能因子；前提是候选因子需有可用的重组蛋白或过表达体系 |
| 解析转录因子对靶基因的直接调控 | CUT&Tag＋荧光素酶报告基因＋定点突变＋过表达/敲低 | 适用于需要区分直接结合与间接调控的场景；CUT&Tag 提供结合位点定位，荧光素酶与突变提供功能证据，过表达/敲低提供表达层面验证 |
| 验证分泌因子在整体代谢中的必要性 | 条件性基因敲除小鼠＋代谢笼＋RNA-seq＋透射电镜 | 适用于需要从整体能量代谢、转录组和细胞器形态多层面确认表型的场景；前提是具备可用的基因编辑模型和稳定冷暴露条件 |
| 判断配体是否直接结合受体 | 共免疫沉淀＋免疫荧光共定位＋受体激动剂回补 | 适用于候选配体与受体相互作用的初步确认；共沉淀与共定位提供结合证据，激动剂回补提供功能依赖证据 |
| 评估候选因子与受体激动剂的协同 | AAV 过表达＋人/鼠脂肪外植体＋OCR 测定＋线粒体染色 | 适用于需要同时评估在体效应与离体协同作用的场景；前提是外植体培养条件稳定，且过表达体系有合适的组织特异性 |
对实验人员来说，上述组合的适用性取决于样品基质和结果用途。血浆蛋白质组学受高丰度蛋白去除方法影响，候选因子的丰度与检出率需要看实际样本；CUT&Tag 需要验证抗体特异性和细胞起始量；代谢笼数据受环境温度、摄食与活动干扰，需要设置适当对照。更稳妥的理解是，将各技术输出视为互补证据，而非单一技术的独立结论。
文献信息
Xue J, Chen D, Wang C, et al. WAT-to-BAT communication facilitates the sustained activation of BAT thermogenesis during cold exposure. Cell Discov. 2026. DOI: 10.1038/s41421-026-00891-8. PMID: 42191682.