癫痫持续状态（status epilepticus，SE）可在海马齿状回颗粒下层引起神经发生的显著改变，并伴随 CA1、CA3 锥体神经元及门区内中间神经元的细胞丢失与凋亡。NDEL1 参与神经元增殖、迁移及轴突再生，VEGF 与其受体 VEGFR-2 同样调控神经元的增殖与迁移。本研究关注的问题是：SE 后海马中 NDEL1 与 VEGF/VEGFR-2 的表达是否存在动态变化，两者是否在同一细胞群体中共定位，以及三者是否可能协同参与 SE 后海马的病理生理过程。研究采用青春期雄性 C57BL/6 小鼠建立毛果芸香碱诱导的癫痫模型，在 SE 后 1、2、3、4 周分别取海马组织，以 Western blot 和 RT-qPCR 检测 NDEL1、VEGF、VEGFR-2 的蛋白与 mRNA 水平，并以免疫荧光标记检测 NDEL1 与 VEGF 在海马内的共定位。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 模型建立与行为学分级 | 腹腔注射毛果芸香碱，Racine 标准评估 | 确认 SE 模型是否成功诱导 | Racine 分级、发作持续时间 |
| 组织取材与切片制备 | 冷冻切片机（Leica CM1850） | 获得可用于免疫荧光的海马冠状切片 | 6 μm 厚脑组织切片 |
| 蛋白表达检测 | Western blot、Amersham Imager 600、ImageJ | 定量 SE 后不同时间点 NDEL1、VEGF、VEGFR-2 蛋白水平 | 蛋白条带灰度值 |
| mRNA 表达检测 | RT-qPCR（Mx3005P） | 定量 SE 后不同时间点 NDEL1、VEGF、VEGFR-2 转录水平 | 相对表达量 |
| 共定位分析 | 免疫荧光、BX53 显微镜 | 判断 NDEL1 与 VEGF 是否在海马同一区域共表达 | 共表达细胞数（N.O./mm²） |
关键环节
模型建立是整个证据链的起点。研究使用 5～6 周龄、体重 20～22 g 的青春期雄性 C57BL/6 小鼠，先腹腔注射东莨菪碱丁基溴以减轻毛果芸香碱的外周副作用，30 min 后按 260～280 mg/kg 剂量腹腔注射毛果芸香碱诱导 SE。发作评估采用 Racine 标准，仅纳入达到 4～5 级且发作持续至少 60 min 的小鼠。SE 后 2 h 注射地西泮终止发作。该环节决定了后续所有时间点数据的解释范围，即实验数据代表的是 SE 后特定时间窗内的海马变化，而非癫痫自发发作期的变化。
组织取材与切片制备为免疫荧光提供材料基础。小鼠经腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉后，经心脏灌注冷 PBS 和 4% 多聚甲醛，脑组织后固定、蔗糖脱水、OCT 包埋后于 –80°C 保存。使用冷冻切片机（Leica，CM1850，德国）制备 6 μm 厚冠状切片，贴于多聚赖氨酸包被载玻片。切片厚度直接影响共定位结果的分辨能力，本研究在讨论中明确指出，6 μm 切片不足以完整显示毛细血管轮廓，这可能解释了本研究中 NDEL1 与 VEGF 仅在神经元中观察到、未沿毛细血管显示的结果。
Western blot 承担蛋白水平的定量任务。海马组织经 RIPA 缓冲液（含 PMSF）裂解、超声破碎、离心后取上清，以 BCA 法测定蛋白浓度。等量蛋白经 8% SDS-PAGE 电泳后转至 PVDF 膜，封闭后分别与 NDEL1（1:300）、VEGF（1:500）、VEGFR-2（1:1000）一抗孵育过夜，再与相应二抗孵育，经增强化学发光试剂显色后，使用 Amersham Imager 600（GE，美国）成像，ImageJ 软件分析条带灰度。该环节产生的蛋白定量数据支持以下结论：NDEL1 与 VEGF 蛋白在 SE 后 1、2、3、4 周均上调；VEGFR-2 蛋白仅在第 1 周升高，第 4 周显著下降。
RT-qPCR 从转录水平验证蛋白表达趋势。总 RNA 经热循环平台（1000-series，BIO-RAD，美国）逆转录为 cDNA，反应体系含 1.5 μg RNA。扩增使用 Mx3005P 实时荧光定量 PCR 系统（Stratagene，美国），95°C 15 min 预变性后，进行 40 个循环（95°C 15 s，60°C 30 s）。NDEL1、VEGF、VEGFR-2 及 β-actin 引物序列均在文献中明确列出。mRNA 数据进一步支持：NDEL1 在 SE 后多个时间点显著升高，VEGFR-2 仅在第 1 周轻度升高。
免疫荧光用于判断 NDEL1 与 VEGF 的空间关系。切片经正常兔血清封闭后，与 NDEL1 一抗（山羊抗小鼠，1:50；Santa Cruz，SC-48063）和 VEGF 一抗（小鼠单克隆抗体，1:100；Santa Cruz，SC-7269）于 4°C 孵育 24 h，再与 Cy3 标记的山羊抗小鼠二抗（1:300）或 Alexa Flour 488 标记的兔抗山羊二抗（1:300）孵育 2 h。封片使用含 DAPI 的 fluoromount-G 溶液。图像采集使用连接数码相机的显微镜（BX53，OLYMPUS，日本），由两名盲法独立评估者在随机区域（20×）测量 CA3 与 DG 面积，并计数 NDEL1 与 VEGF 共表达细胞数（N.O./mm²）。该环节显示：NDEL1 与 VEGF 在 CA3 锥体细胞层及 DG 颗粒层和多形层中广泛共表达，但在 SE 后 CA3 和 DG 中共表达细胞数减少。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | 冷冻切片机与免疫荧光显微镜 | 切片厚度决定免疫荧光能否完整显示目标结构，6 μm 切片限制了对毛细血管内表达的判断 |
| 互补验证 | Western blot 与 RT-qPCR | 分别从蛋白和 mRNA 水平验证 NDEL1、VEGF、VEGFR-2 的表达趋势，蛋白与转录数据在 NDEL1 和 VEGFR-2 上相互支持 |
| 空间印证 | 免疫荧光与 Western blot | 免疫荧光提供共定位的空间信息，Western blot 提供全海马的定量信息，二者结合说明蛋白总量上调与共表达细胞数减少可同时存在 |
| 时间维度 | 多时间点取材与各检测技术 | 1、2、3、4 周四个时间点使 VEGFR-2 的早期升高与后期下降得以区分于 NDEL1 和 VEGF 的持续上调 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 判断两个蛋白在脑区是否共定位 | 冷冻切片机 + 双标免疫荧光 + 荧光显微镜 | 可在同一组织切片上同时显示两个蛋白的空间分布，并通过共表达细胞计数获得半定量数据 |
| 判断目标分子在疾病模型中的表达动态 | Western blot + RT-qPCR + 多时间点取材 | 从蛋白和 mRNA 两个层面确认表达变化趋势，减少单一方法带来的误判 |
| 初步判断配体与受体的表达关系 | Western blot 检测配体与受体 + 免疫荧光共定位 | 可区分配体与受体在时间趋势上的一致性或不一致性，为后续机制实验提供方向 |
对实验人员来说，上述组合的适用前提是能够建立稳定的 SE 模型并获得足够量的海马组织。需要注意的是，免疫荧光共定位的判读受切片厚度和抗体穿透能力影响；在本研究中，6 μm 切片未能显示毛细血管内的表达，提示涉及血管结构的共定位研究可能需要更厚的切片。此外，本研究未控制切片曝光时间，因此未对荧光强度进行定量，共定位数据以细胞计数而非荧光强度呈现。如果研究目标涉及蛋白间直接相互作用，免疫荧光共定位只能提供空间上的提示，更稳妥的做法是结合免疫共沉淀等实验进一步验证。
文献信息
Zhu L, Dai S, Lu D, et al. Role of NDEL1 and VEGF/VEGFR-2 in Mouse Hippocampus After Status Epilepticus. ASN Neuro. 2020;12:1759091420926836. doi:10.1177/1759091420926836. PMID: 32423231.