肠道黏膜屏障如何区分共生菌与致病菌、并阻止细菌黏附于上皮，是黏膜免疫领域的核心问题。本研究围绕 HMGB1 在结肠黏液中的宿主防御功能展开，综合运用免疫荧光成像、流式细胞术、免疫印迹、ELISA、HTRF、Sulfo-SBED 标记转移、16S rRNA 基因测序及体外黏附与侵袭模型，构建了从组织定位、蛋白结合定量到细菌功能表型的证据链。免疫荧光成像显示 HMGB1 在结肠黏液层呈连续分布，溃疡性结肠炎（UC）活动期该层断裂或缺失；流式细胞术以 FimH 敲除与回补菌株为材料，定量证实 HMGB1 与 FimH 中 ToH1 序列的特异性结合；16S rRNA 测序则用于判断 HMGB1 缺失是否通过改变菌群组成影响细菌定位。上述技术组合共同支持 HMGB1 直接靶向细菌黏附素的因果机制。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 结肠组织 HMGB1 定位 | 免疫荧光成像、共聚焦显微镜 | HMGB1 是否定位于结肠黏液层，UC 中是否改变 | HMGB1 荧光信号、表面 HMGB1 定量（RFU/μm²） |
| HMGB1 来源与释放条件 | 条件性基因敲除小鼠、ELISA、免疫印迹 | 黏液 HMGB1 是否来源于肠上皮细胞，是否依赖菌群 | HMGB1 浓度、免疫印迹条带 |
| 细菌空间定位与菌群组成 | FISH、qPCR、16S rRNA 测序 | HMGB1 缺失是否改变细菌与上皮的距离及菌群组成 | 细菌-上皮距离、16S 拷贝数、ASV 丰度 |
| 黏液侵袭与细菌聚集 | 趋化小室、宽场荧光显微镜 | HMGB1 是否阻止细菌侵入黏液并诱导聚集 | 黏液内荧光比例、聚集图像 |
| 上皮黏附与侵袭 | 体外黏附实验、庆大霉素保护实验、荧光成像 | HMGB1 是否直接阻断细菌黏附与侵袭 | 黏附荧光信号、胞内 CFU |
| HMGB1 与 FimH 结合 | 流式细胞术、Sulfo-SBED 标记转移、HTRF | HMGB1 是否结合 FimH，结合是否依赖 ToH1 | 结合阳性细菌比例、标记转移条带、Kd 值 |
| FimH 功能与细菌表型 | 红细胞凝集实验、甘露糖包被板结合实验 | ToH1 突变是否影响 FimH 黏附功能 | 凝集效价、蛋白结合百分比 |
| FimH 表达调控 | 免疫印迹、相变 PCR、免疫荧光 | HMGB1 是否抑制 FimH 表达及相变开关 | FimH 条带密度、相变 PCR 条带、FimH⁺ 细菌计数 |
| UC 患者样本验证 | 免疫荧光成像、定量图像分析 | UC 中 HMGB1 缺失是否伴随 FimH⁺ 黏附菌增多 | HMGB1 与 FimH⁺ 细菌定量、相关性模型 |
关键环节
HMGB1 在结肠黏液中的定位与来源
研究首先需要确定 HMGB1 是否存在于结肠黏液层，以及其释放是否依赖肠道菌群。采用甲基-卡诺固定液保存黏液结构，结合免疫荧光染色标记 HMGB1 与 Hoechst，在宽场荧光显微镜与共聚焦显微镜下采集图像。定量分析显示，对照组结肠黏液层中 HMGB1 呈连续分布，而活动期 UC 病变区域 HMGB1 层断裂，无上皮区域完全缺失，且表面 HMGB1 水平与炎症严重程度呈负相关。该定位数据建立了 HMGB1 作为黏液屏障组分的空间证据。
为追溯细胞来源，研究使用肠上皮细胞特异性 HMGB1 敲除（HMGB1ΔIEC）小鼠及其野生型同窝对照。免疫荧光和免疫印迹显示，HMGB1ΔIEC 小鼠结肠表面无 HMGB1 信号，黏液 HMGB1 浓度降低。无菌小鼠肠上皮内 HMGB1 总量与 SPF 小鼠相当，但细胞外及粪便中检测不到 HMGB1，提示菌群信号驱动 HMGB1 从上皮释放至黏液。ELISA 和免疫印迹在此环节承担了定量与半定量验证功能。
细菌空间定位与菌群组成的区分
HMGB1 缺失导致细菌与上皮接触增加，但这一表型可能源于菌群组成改变，也可能源于宿主防御失效。研究采用荧光原位杂交（FISH）以 EUB338 探针标记细菌，结合 Hoechst 标记宿主细胞核，在组织切片中测量细菌与上皮表面的距离；同时以 qPCR 检测结肠组织中细菌 16S rRNA 基因拷贝数。HMGB1ΔIEC 小鼠中细菌与上皮距离显著缩短，组织相关细菌 16S 拷贝数升高。
为排除菌群组成变化的干扰，研究对同窝共饲养的 HMGB1WT 与 HMGB1ΔIEC 小鼠的粪便和黏膜刮取物进行 16S rRNA 基因测序，采用 DADA2 流程生成 ASV 表，并进行 α 多样性、β 多样性及 PERMANOVA 分析。结果显示两组在整体群落水平存在差异，但仅少数 ASV 达到显著差异；黏膜相关菌群与粪便菌群在 HMGB1ΔIEC 小鼠中区分度下降，提示 HMGB1 主要影响细菌的空间分布而非菌群组成。16S 测序在此提供的是排除性证据，而非直接机制证据。
黏液侵袭与细菌聚集的体外验证
为直接检验 HMGB1 是否阻止细菌侵入黏液，研究从 HMGB1WT 与 HMGB1ΔIEC 小鼠分离黏液，加载至趋化小室两侧，将荧光标记的结肠细菌加载至中央通道。宽场荧光显微镜采集黏液前缘图像，ImageJ 定量黏液内荧光比例。结果显示细菌对两侧黏液具有同等可及性，但大多数侵入 HMGB1ΔIEC 黏液，表明 HMGB1 缺失降低黏液对细菌的阻挡能力。
细菌聚集实验将荧光标记的结肠细菌与标记的重组 HMGB1（rHMGB1）共孵育，以宽场荧光显微镜成像。HMGB1 使样本中几乎所有类型的细菌发生聚集。该环节说明 HMGB1 不依赖杀菌作用，而是通过物理聚集限制细菌运动。
上皮黏附与侵袭的直接阻断
细菌突破黏液后可能黏附并侵入上皮。研究以 Caco2 细胞为模型，将荧光标记的结肠细菌与 rHMGB1 共处理后加入野生型或 HMGB1 缺陷（ΔHMGB1）Caco2 细胞。免疫荧光成像和定量显示，ΔHMGB1 细胞表面细菌覆盖明显多于野生型，而加入 rHMGB1 后黏附水平恢复至野生型。庆大霉素保护实验进一步以 CFU 计数显示，ΔHMGB1 细胞内细菌回收数高于野生型，rHMGB1 处理可逆转该差异。
为排除 rHMGB1 通过作用于上皮细胞间接影响黏附，研究采用纤连蛋白包被的无细胞黏附实验，结果显示 rHMGB1 直接降低细菌与纤连蛋白的结合。该环节以细胞模型和蛋白包被表面两种方式，将 HMGB1 的作用定位为直接靶向细菌。
HMGB1 与 FimH 的特异性结合
分子机制层面，研究基于 PROSITE 数据库搜索，在 FimH 中鉴定出与 Beclin-1 和 Atg5 中 HMGB1 结合基序相似的 ToH1 序列。为验证 HMGB1 与 FimH 的结合依赖 ToH1，研究使用 FimH 敲除大肠杆菌（ΔFimH），并回补野生型 FimH 或 ToH1 突变型 FimH。细菌在诱导 1 型菌毛条件下培养后，与 rHMGB1 共孵育，采用 Attune NxT 流式细胞术检测细菌结合信号。结果显示，表达野生型 FimH 的细菌中约 50% 结合 rHMGB1，而 FimH 缺失或表达突变型 FimH 的细菌结合显著降低。流式细胞术在此提供了单细胞水平的结合定量，区分了结合阳性与阴性细菌群体。
为进一步确认结合特异性，研究采用 Sulfo-SBED 标记转移实验，将标记从 rHMGB1 转移至重组 FimH 凝集素结构域（rFimHLD），结果显示野生型 rFimHLD 接受标记，而 ToH1 突变体不接受。同时，HTRF 实验测定 HMGB1 与 FimH 的解离常数（Kd）为 62.84 nM，且甘露糖存在不影响该结合，说明 ToH1 位点不同于 FimH 的甘露糖结合位点。该环节以流式细胞术、标记转移和 HTRF 三种技术互补，分别提供结合特异性、直接分子互作和亲和力定量数据。
ToH1 对 FimH 黏附功能的影响
为检验 ToH1 是否为 FimH 黏附功能所必需，研究以大肠杆菌 SWW33 为材料，进行红细胞凝集实验和甘露糖包被板结合实验。红细胞表面含甘露糖，凝集实验反映细菌与红细胞交联能力。结果显示，ToH1 突变使大肠杆菌凝集红细胞的能力降至 FimH 敲除水平，而野生型 FimH 细菌保持凝集。此外，rHMGB1 以剂量依赖性方式抑制 FimH 与甘露糖包被板的结合。该环节将 ToH1 从结合位点提升为黏附功能的关键序列。
HMGB1 对 FimH 表达的抑制
细菌在接触 HMGB1 后可能下调 ToH1 黏附素表达。研究以非致病性大肠杆菌 SWW33 暴露于 rHMGB1，免疫印迹显示 FimH 蛋白量降低。为区分 HMGB1 是阻止相变开关开启还是促进关闭，研究使用 FimE 敲除菌株（ΔFimE），该菌株可切换至 FimON 但难以关闭。以 HMGB1WT 或 HMGB1ΔIEC 肠上皮细胞条件培养基处理 ΔFimE 菌株，并通过相变区域 PCR 检测开关状态。结果显示，仅含 HMGB1 的条件培养基抑制 FimON，且向 HMGB1ΔIEC 条件培养基中补充 rHMGB1 可恢复抑制效果。体内实验中，HMGB1ΔIEC 小鼠黏液 FimH 蛋白量高于野生型，免疫荧光显示黏膜表面 FimH⁺ 细菌增多，且部分细菌位于上皮细胞内。该环节以免疫印迹、相变 PCR 和免疫荧光共同表明 HMGB1 抑制细菌黏附机制的表达。
UC 患者样本中的验证
最后，研究在已表征表面 HMGB1 的同一 UC 患者与对照的连续组织切片中进行 FimH 免疫荧光染色。定量分析显示，UC 患者组织相关 FimH⁺ 细菌数高于非 IBD 对照，且 HMGB1 与 FimH⁺ 细菌数呈反向关系，非线性回归模型显示 FimH⁺ 细菌数可由 HMGB1 水平预测。该环节将体外与小鼠机制数据与人类疾病样本关联，提示 UC 中 HMGB1 防御失效伴随靶向细菌的黏附增加。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 空间定位与定量验证 | 免疫荧光成像、ELISA、免疫印迹 | 免疫荧光提供组织定位，ELISA 和免疫印迹定量黏液和上皮中的 HMGB1 水平 |
| 排除性证据 | 16S rRNA 测序、FISH、qPCR | 16S 测序排除菌群组成变化，FISH 和 qPCR 确认细菌空间定位与组织载量变化 |
| 结合特异性与亲和力互补 | 流式细胞术、Sulfo-SBED 标记转移、HTRF | 流式细胞术定量细菌结合比例，标记转移证明直接分子互作，HTRF 测定 Kd 值 |
| 功能与表达调控验证 | 红细胞凝集实验、免疫印迹、相变 PCR | 凝集实验反映黏附功能，免疫印迹和相变 PCR 揭示 HMGB1 对 FimH 表达的抑制 |
| 模型与人类样本关联 | 基因敲除小鼠、UC 患者组织免疫荧光 | 小鼠模型建立因果机制，患者样本验证 HMGB1 与 FimH⁺ 细菌的反向关系 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 判断宿主蛋白是否直接结合细菌表面黏附素 | 基因敲除与回补菌株、流式细胞术、Sulfo-SBED 标记转移 | 流式细胞术提供单细胞结合比例，标记转移验证直接互作，基因回补排除菌株背景差异 |
| 定位宿主防御蛋白与细菌在组织中的空间关系 | 免疫荧光成像、FISH、共聚焦显微镜 | 免疫荧光标记宿主蛋白，FISH 标记细菌，共聚焦成像可同时解析两者空间分布 |
| 排除菌群组成变化对细菌定位表型的干扰 | 16S rRNA 基因测序、qPCR | 16S 测序判断群落结构是否改变，qPCR 定量组织相关细菌载量 |
| 验证宿主蛋白对细菌黏附功能的影响 | 体外黏附实验、庆大霉素保护实验、荧光成像 | 黏附实验反映表面结合，庆大霉素保护实验反映侵袭能力，荧光成像提供可视化证据 |
| 解析宿主蛋白对细菌黏附素表达的调控 | 免疫印迹、相变 PCR、免疫荧光 | 免疫印迹定量蛋白表达，相变 PCR 判断开关状态，免疫荧光定位表达细菌 |
在类似研究中，若研究目标是判断某一宿主蛋白是否直接作用于细菌黏附素，可优先建立基因敲除与回补菌株，结合流式细胞术进行结合定量。需要注意的是，流式细胞术检测细菌结合时，需设置 FimH 缺失和 ToH1 突变对照，以区分非特异性结合；免疫荧光定位需注意固定方式对黏液结构的保存，甲基-卡诺固定液在本研究中用于维持黏液层完整性。16S rRNA 测序适合排除菌群组成变化的干扰，但若差异主要体现在细菌空间分布而非群落结构，需结合 FISH 或 qPCR 提供组织载量数据。HTRF 和标记转移实验对蛋白纯度和标记效率要求较高，更适合在已有结合初筛结果后用于验证直接互作。研究组合的适用前提是具备可遗传操作的细菌菌株和相应的宿主基因敲除模型，边界在于体外实验不能完全模拟体内黏液层的复杂组成和动态更新。
文献信息
Overstreet AC, Burge M, Anderson B, et al. HMGB1 functions as a critical mediator of host defense at the gut mucosal barrier. Cell Host Microbe. 2026. PMID: 41638212. DOI: 10.1016/j.chom.2026.01.008.