CuET 纳米晶体的 HPLC-MS/MS、DLS、TEM 与 XRD 表征及抗焦亡药效评价

双硫仑（DSF）经药物重定位被发现具有抗焦亡活性，Cu2+ 可增强该活性，但其机制尚不明确。本研究确认增强作用源于细胞内原位生成铜-二乙基二硫代氨基甲酸酯配合物 CuET，CuET 通过干扰 NLRP3 与 NEK7 的结合特异性抑制 NLRP3 炎症小体组装，抗焦亡活性强于 DSF。由于 CuET 水溶性和渗透性均较差，属 BCS Ⅳ 类药物，研究采用金属配位驱动自组装方法制备 CuET 纳米晶体（CuET NCs），以 HPLC-MS/MS 完成细胞内 CuET 定量、Caco-2 跨膜转运检测、血浆及组织药物浓度测定，以 DLS、TEM、UV-Vis、FTIR、XRD 完成理化表征，最终在 DSS 诱导结肠炎小鼠模型中评价体内药效。

整体证据链由「纳米晶体制备—理化性质确证—细胞水平活性筛选—体内药效验证—口服药代与组织分布」构成：HPLC-MS/MS 在细胞裂解液、转运液、血浆和组织匀浆中定量 CuET，支撑原位生成、渗透性、生物利用度和肠道分布等关键结论；DLS、TEM、UV-Vis、FTIR、XRD 从粒径、形貌、化学配位和晶体结构层面确证纳米晶体的形成。

实验流程

关键环节

细胞内 CuET 的原位生成是解释 Cu2+ 增强 DSF 抗焦亡活性的核心证据。实验以原代腹腔巨噬细胞为模型，在 LPS 预处理后加入不同浓度 Cu2+ 与 2 μmol/L DSF，采用冻融联合超声破碎细胞，以四倍体积甲醇沉淀蛋白，离心后取上清进样。HPLC-MS 在正离子模式下以单离子监测 m/z 359 定量 CuET，标准曲线由空白胞浆加标模拟样品处理绘制。数据表明，Cu2+/DSF 组检测到 CuET 且浓度随 Cu2+ 浓度升高而增加，而游离 DSF 组即使达到 30 μmol/L 也未检出 CuET，说明 CuET 在细胞内原位生成，并提示 DSF 与 CuET 的抗焦亡机制存在差异。

成药性评价环节解决 CuET 能否作为候选药物的前置问题。溶解度测定采用试管平衡法，以 HPLC-UV 在 433 nm 检测，显示 CuET 在水和常见有机溶剂中溶解度均较低，属难溶性药物。渗透性评价采用 Caco-2 单层 Transwell 模型，以 EVOM2 监测跨膜电阻确认单层完整性，双向转运样品经 HPLC-MS/MS 测定，计算 Papp 与外排比。结果显示 Papp（AP→BL）小于 1 × 10⁻⁶，ER 约为 1，提示 CuET 为被动转运且渗透性差，综合归类为 BCS Ⅳ 类。该数据为后续采用纳米晶体制剂解决成药性缺陷提供了直接依据。

CuET NCs 的制备与理化表征环节用于确认制剂形成并解释其结构基础。制备以 DTC 与 Cu2+ 按固定摩尔比 2/1 在超纯水中进行，PVP 作为稳定剂，CuCl2 溶液经恒流泵缓慢滴加，全程无需有机溶剂。DLS 测得平均粒径约 90 nm、表面电荷 −4.5 mV；TEM 显示纳米晶体呈不规则无定形形貌，与金属配位聚合物结构一致。UV-Vis 在 443 nm 出现新吸收峰，FTIR 显示 DTC 中 1140 cm⁻¹（vC=S）和 910 cm⁻¹（vC-S）峰在 CuET NCs 中消失，提示 C–S 与 C=S 基团参与 Cu2+ 配位。XRD 在 10.1°、11.9°、12.4°、14.4°、21.4°、24.1° 处出现衍射峰，与标准库中 CuET 化合物的前六个强峰一致，确认纳米晶体的晶态结构。DLS 与 TEM 补充粒径和形貌信息，UV-Vis、FTIR 与 XRD 从化学键和晶体结构层面共同确证 CuET 的原位生成。稳定性实验显示，CuET NCs 在超纯水、生理盐水、小鼠血清和 RPMI 1640 完全培养基中 75 h 内粒径无显著变化，4 °C 水中可稳定储存至少 60 天。

细胞水平抗焦亡活性评价用于判断 CuET NCs 的作用范围。以 LPS 联合 nigericin、ATP、MSU 激活 NLRP3 炎症小体，以转染 LPS 激活非经典炎症小体，以 flagellin 激活 NLRC4，以 poly(da:dT) 激活 AIM2。CuET NCs 在 2 μmol/L 即特异性抑制 NLRP3 炎症小体激活引起的 LDH 释放和 IL-1β 分泌，对 TNF-α 和 IL-6 无显著影响，对其他三类炎症小体无明显作用，Western blot 显示 GSDMD 剪切被完全抑制。人 THP-1 细胞中重复验证了该特异性。与 DSF 需约 30 μmol/L 才发挥显著抑制相比，CuET 在更低剂量起效，提示其抗焦亡活性更强且机制不同。

机制验证环节围绕 NLRP3 炎症小体组装的上游事件展开。免疫荧光显示 CuET NCs 显著降低 ATP 或 nigericin 刺激下含 ASC 斑点的细胞比例，交联实验进一步显示 ASC 寡聚化被抑制。免疫共沉淀与 Western blot 表明，CuET NCs 抑制 NLRP3 与 ASC 的相互作用，并破坏 NLRP3 与 NEK7 的结合，据此将 CuET NCs 的作用位点定位在 NLRP3 炎症小体组装阶段。

血浆蛋白结合分析解释了 CuET 在生物基质中信号衰减的原因。CuET 在血浆或 BSA 中随时间逐渐降低，而在水中稳定。荧光猝灭实验显示 BSA 荧光随 CuET 浓度升高而降低且发射波长无明显位移，Stern-Volmer 曲线线性良好，Kq 超过生物大分子最大扩散常数，提示以静态猝灭为主。双对数回归得到结合常数 Ka 在 298 K 和 310 K 分别为 (1.37 ± 0.39) × 10⁴ 和 (5.38 ± 2.76) × 10⁴ L/mol，结合位点数约 0.81～1.02。CD 光谱显示 CuET 使 BSA 的 α-螺旋结构部分展开。基于上述结果，CuET 检测方法在盐冰浴条件下建立，以降低生物基质干扰。

口服药代与组织分布环节以 UPLC-MS/MS 完成血浆和组织样品定量。SD 大鼠单次口服 60 mg/kg CuET NCs 或 CuET SP，血浆样品经冰冷乙腈沉淀蛋白后分析，组织样品在液氮中速冻后以冰冷丙酮匀浆。结果显示 CuET NCs 的 AUC0-24 为 CuET SP 的 6 倍，Tmax 为 4.67 ± 0.94 h，T1/2 为 8.51 ± 1.68 h。组织分布显示 CuET 主要分布于胃、肠、脂肪组织和骨骼肌，并在这些组织中至少维持 12 h，而肝、肾浓度较低。肠道高分布结果为选择 DSS 诱导结肠炎模型提供了依据。

体内药效评价包含 LPS 脓毒症模型和 DSS 结肠炎模型。LPS 模型中，CuET NCs 减轻体温下降、降低血清 IL-1β 水平约 47%～60%，IL-6 未受影响，并改善肺和肝组织病理改变。DSS 结肠炎模型中，每日记录体重、粪便性状和便血以计算 DAI，第 8 天测量结肠长度，并检测结肠组织 NLRP3、GSDMD-NT 表达和 ASC 寡聚化，同时进行 H&E 染色。CuET NCs 治疗改善体重下降和 DAI 评分，恢复结肠长度，降低 NLRP3 与 GSDMD-NT 表达，抑制 ASC 斑点形成，并减轻黏膜损伤和单核细胞浸润。这些结果与体外机制数据相互印证，构成从分子、细胞到整体的药效证据链。

技术协同

研究组合

文献信息

Xueming Xu, Yuanfeng Han, Jiali Deng, Shengfeng Wang, Shijie Zhuo, Kai Zhao, Wenhu Zhou. Repurposing disulfiram with CuET nanocrystals: Enhancing anti-pyroptotic effect through NLRP3 inflammasome inhibition for treating inflammatory bowel diseases. Acta Pharm Sin B, 2024. PMID: 38828135. DOI: 10.1016/j.apsb.2024.03.003.