靶向 cGAS-STING 通路是肿瘤免疫治疗的重要方向，但 STING 激动剂在临床试验中的疗效并不理想。TREX1 是哺乳动物细胞内主要的 3′ DNA 外切酶，通过降解胞质 DNA 抑制 cGAS-STING 介导的 I 型干扰素应答，从而构成一种「固有免疫检查点」。本研究以无细胞 DNase 实验为核心建立高通量小分子抑制剂的筛选流程，鉴定出选择性抑制 TREX1 的化合物 296，并通过细胞、动物模型和可诱导全身敲除小鼠系统评价其抗肿瘤疗效与免疫安全性。高内涵筛选平台承担活性化合物的发现与初筛，qRT-PCR、流式细胞术、ELISA、IHC 和小鼠肿瘤模型共同构成从分子活性到体内药效与安全性的验证链条。
研究同时评估了两类靶向 TREX1 的治疗模式：小分子抑制剂 296 和作为自体肿瘤疫苗的 Trex1 敲除肿瘤细胞。在动物层面，通过 Ifnar1−/−、Sting1−/−、Rag1−/− 及 NSG 小鼠和 Trex1fl/flUBCCreERT2 可诱导敲除小鼠，区分肿瘤内在信号与宿主免疫应答的贡献，从而明确疗效依赖 IFNAR 和适应性免疫，并证明成年小鼠全身性 TREX1 缺失在 6 个月内未引起严重免疫毒性。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 重组人 TREX1 蛋白制备 | Ni-NTA 亲和层析、超声裂解、Western blot | 获得可用于体外筛选的纯化酶 | 蛋白纯度与浓度数据 |
| 无细胞 DNase 实验建立 | SYBR Gold 荧光标记 ssDNA、Synergy HT 酶标仪 | 建立可检测 TREX1 核酸酶活性的体外体系 | 荧光强度-时间曲线 |
| 高通量化合物筛选 | Echo 声波移液系统、MultiFlo FX 液体处理器、EnVision 酶标仪、Genedata Screener | 从大化合物库中识别 TREX1 抑制剂 | Z′ 因子、斜率、RZ 分数、qAC50 |
| 细胞毒性初筛 | IncuCyte S3 活细胞成像系统 | 剔除高细胞毒性化合物 | 细胞汇合度-时间曲线 |
| IC50 与选择性测定 | 无细胞 DNase 实验、Synergy HT 酶标仪 | 确定候选化合物对 TREX1 与 DNase I 的抑制活性 | 剂量-反应曲线、IC50 |
| 分子对接 | CB-Dock2 服务器、PDB 7TQN | 分析化合物与 TREX1 催化口袋的相互作用 | 对接构象、氢键位点 |
| 细胞功能验证 | qRT-PCR、CFX Connect 系统、cGAMP ELISA | 检测 IFN-I 信号与 cGAMP 水平 | 免疫基因 mRNA 倍数变化、cGAMP 浓度 |
| 体内药效评价 | MC38、B16-F10、E0771、LLC 小鼠肿瘤模型、游标卡尺 | 评价单药及联合治疗的抗肿瘤活性 | 肿瘤体积、生存曲线 |
| 免疫微环境分析 | 流式细胞术（CytoFLEX）、FlowJo、IHC、QuPath | 分析肿瘤浸润免疫细胞组成与功能状态 | 免疫细胞频率与数量、标记物表达 |
| 自体疫苗实验 | Trex1KO MC38/B16-F10 细胞、H&E 染色、QuPath | 评价敲除肿瘤细胞的系统免疫保护作用 | 肿瘤生长、肺转移灶数量与面积 |
| 系统免疫安全性评估 | Bio-Plex 23-plex 细胞因子检测、CRP ELISA、组织 H&E 与 CD45 IHC | 评估全身性 TREX1 失活的免疫毒性 | 血清细胞因子谱、CRP、体重、脾重、组织免疫浸润 |
关键环节
无细胞 DNase 实验是整个筛选流程的起点。研究者将 30-mer ssDNA 与 SYBR Gold 结合，SYBR Gold 仅在稳定嵌入 ssDNA 时发出荧光，TREX1 降解 ssDNA 后荧光信号逐渐降低。该体系在 Synergy HT 酶标仪上以 FITC 485/535 滤光片每 2 分钟读取一次荧光，可实时反映酶促反应动力学。TREX1 的降解活性呈剂量依赖性，EDTA 螯合 Mg2+ 后反应完全抑制，DNase I 在 60 分钟内不显著降解 ssDNA，说明该底物对 TREX1 具有较好的适用性。qRT-PCR 在 MC38 细胞中检测 Ifnb1、Cxcl10、Ccl5、Tnf、Il6 五个免疫基因，用于确认候选化合物是否在细胞水平诱导 cGAS-STING 下游转录。流式细胞术在肿瘤消化后以 CD45、CD3、CD8、CD4、CD11b、PD-1、GZMB、SCA-1 等抗体标记，输出各免疫细胞亚群的频率、数量和功能标记物表达，用于连接体外活性与体内免疫微环境改变。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 筛选与反筛 | EnVision 酶标仪、IncuCyte S3 | 先以无细胞 DNase 实验筛选活性化合物，再以细胞增殖实验剔除高毒性候选物，形成活性与安全性的双重过滤 |
| 互补验证 | 无细胞 DNase 实验、qRT-PCR | 前者确认化合物对 TREX1 酶活性的直接抑制，后者确认该抑制在细胞中转化为 IFN-I 信号 |
| 机制验证 | 分子对接、Ifnar1−/− 小鼠 | 对接提示化合物与催化口袋结合，Ifnar1−/− 小鼠证明体内疗效依赖 IFNAR 信号 |
| 疫苗与机制分离 | Trex1KO 细胞、Sting1−/− 与 Rag1−/− 小鼠 | 通过宿主基因缺陷区分肿瘤内在 cGAS-STING 信号与宿主 STING、适应性免疫的贡献 |
| 疗效与安全并行 | 肿瘤模型、Bio-Plex、CRP ELISA、组织 IHC | 在同一治疗框架下并行评价抗肿瘤活性和全身免疫毒性 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 建立核酸酶抑制剂高通量筛选 | 无细胞荧光 DNase 实验 + Echo 声波移液 + EnVision 酶标仪 + Genedata Screener | 以荧光信号变化为读数，通过 Z′ 因子和 RZ 分数控制筛选质量，适合从大化合物库中快速识别酶活性抑制剂 |
| 候选化合物早期脱靶与毒性评估 | 无细胞 DNase 实验 + IncuCyte 活细胞成像 + 平行酶选择性实验 | 在同一实验周期内比较靶酶与同家族酶的抑制活性，并以活细胞成像排除高毒性化合物 |
| 免疫治疗药效机制验证 | qRT-PCR + 流式细胞术 + 基因敲除小鼠模型 + IHC | 从转录、细胞表型、遗传依赖性和组织空间分布多个层面确认疗效机制 |
| 治疗性疫苗或细胞治疗评价 | 基因敲除肿瘤细胞 + 皮下/静脉肿瘤挑战模型 + H&E 与 QuPath 定量 | 评价细胞疫苗对原发瘤和转移瘤的保护作用，适合需要区分预防性与治疗性给药的场景 |
| 系统给药免疫安全性评估 | 可诱导全身敲除小鼠 + Bio-Plex 多因子检测 + CRP ELISA + 组织 H&E 与 CD45 IHC | 以多时间点、多组织指标评估全身靶点失活的免疫毒性，适合靶点安全性窗口判断 |
在类似研究中，如果研究目标是发现新的固有免疫检查点抑制剂，可优先建立稳定的无细胞酶活实验，并将其与细胞水平 IFN 报告基因或 qRT-PCR 作为二级筛选。若研究关注体内药效与安全性，则需要在同一种动物模型中并行设置疗效终点和免疫毒性终点，并利用基因敲除小鼠区分靶点依赖与非靶点效应。需要注意的是，本研究中化合物 296 的体内稳定性与药理学仍需进一步优化，IL-12p40 升高提示未来临床转化需要关注剂量优化和 IL-12 相关毒性监测。这些前提会影响仪器组合的取舍和验证强度。
文献信息
Xing C, Tu X, Huai W, et al. Targeting Innate Immune Checkpoint TREX1 Is a Safe and Effective Immunotherapeutic Strategy in Cancer. Cancer Research, 2025. PMID: 40327609. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-24-2747.