本研究针对 SARS-CoV-2 疫苗研发中的免疫原性评价问题，构建了以人复制缺陷型腺病毒 HAdV-C5（E1、E3 缺失）为载体的重组腺病毒疫苗 Ad-S1，插入片段为经密码子优化、编码截短 S1 蛋白的 2043 bp 基因。研究先用 PCR、Western blot 与间接免疫荧光确认 S1 在 HEK293 细胞中的转录与蛋白表达，再以 C57BL/6 小鼠为模型进行免疫，通过 ELISA 检测结合抗体、假病毒与活病毒中和试验评估体液免疫的抗感染活性，并以细胞因子检测分析 Th1 偏向的细胞免疫。核心仪器与技术分别承担表达验证、滴度测定、免疫应答定量和抗病毒功能判定，共同构成从载体构建到免疫原性确认的证据链。
对实验人员来说，该研究的可借鉴之处在于：表达验证、滴度测定与免疫学检测各自产生独立数据，且相互衔接。Western blot 给出蛋白分子量是否相符，免疫荧光给出细胞内表达定位，滴度数据保证免疫剂量一致，ELISA 与中和试验分别反映结合能力与功能活性，细胞因子谱则提示免疫应答偏向，单一环节的结果不足以支撑疫苗免疫原性的结论。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 重组腺病毒构建与鉴定 | PCR、限制性内切酶克隆、HEK293 细胞共转染 | 外源 S1 基因是否正确插入并包装成重组腺病毒 | 凝胶电泳条带、测序一致性结果 |
| S1 表达验证 | 实时荧光定量 PCR、Western blot、间接免疫荧光 | S1 是否在细胞中转录并表达为预期分子量蛋白 | mRNA 表达量、约 75 kDa 条带、绿色荧光定位图像 |
| 腺病毒滴度测定 | 24 孔板梯度稀释、免疫染色、倒置显微镜计数 | 确定病毒滴度以保证免疫剂量准确 | 阳性细胞计数、pfu/mL 滴度 |
| 小鼠免疫与采血 | 肌肉注射免疫、D0/D14 方案、外周血与眶后静脉采血 | 建立可评价的免疫时间轴 | D14、D28 血清样本 |
| 结合抗体检测 | ELISA、酶标仪 450/630 nm 读数 | 免疫后是否产生 S1 特异性结合抗体 | IgG 滴度、GMT |
| 中和抗体检测 | VSV 假病毒中和试验、活病毒中和试验（Vero E6 细胞、CPE 观察） | 血清是否具备抗 SARS-CoV-2 感染的功能活性 | 中和滴度、GMT |
| 细胞因子检测 | MSD 多因子检测 | 疫苗是否诱导 Th1 偏向的细胞免疫 | IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 等细胞因子浓度 |
关键环节
重组腺病毒构建与表达验证
该环节回答的核心问题是：插入的 S1 基因是否成功进入腺病毒载体，并在宿主细胞中表达为预期蛋白。研究将优化后的 S1 基因克隆至 pDC316 载体形成穿梭质粒，与骨架质粒 pBHGloxΔE1,3Cre 共转染 HEK293 细胞，经反复冻融与离心获得初代病毒液，再经蚀斑纯化、扩增得到 Ad-S1。PCR 鉴定显示重组质粒含目标基因，测序结果与设计一致。
表达验证由三种技术分担。实时荧光定量 PCR 检测 HEK293 细胞中 S1 mRNA 水平，结果显示 S1 mRNA 表达显著高于对照组，说明基因在转录水平有效表达。Western blot 中，细胞裂解液与上清经 SDS-PAGE 分离后转至 PVDF 膜，用 SARS-CoV-2 Spike 抗体（1:5000）和 HRP 标记二抗（1:10000）孵育，ECL 显色后在 Bio-Rad 成像设备中观察，检测到约 75 kDa 的条带，与预期位置一致。间接免疫荧光中，Ad-S1 感染 HEK293 细胞 48 h 后固定、透化、封闭，依次加入 Spike 抗体（1:2000）和 Alexa Fluor 488 标记二抗，DAPI 复染细胞核，用 EVOS M7000 成像系统观察，可见绿色荧光信号与细胞核定位。三者分别从转录、蛋白分子量和细胞内表达三个层面构成表达证据，缺少其中任何一项，S1 表达结论的可信度都会下降。
腺病毒滴度测定
滴度测定决定后续免疫实验中每只小鼠实际接种的病毒颗粒数是否可控。研究将 HEK293 细胞铺于 24 孔板，对病毒样品做十倍梯度稀释，取 10⁻⁵～10⁻⁸ 稀释度感染细胞 48 h，甲醇固定后用小鼠抗腺病毒 Hexon 抗体（1:2000）和 HRP 标记二抗（1:1000）染色，在 OLYMPUS CKX53 倒置显微镜下计数阳性细胞，按公式换算滴度。五个视野平均 6 个阳性细胞、稀释倍数 10⁸ 时，计算得到 Ad-S1 滴度为 4.74 × 10¹¹ pfu/mL。该数据说明病毒制备达到了可用于动物免疫的滴度水平，也为不同组别间剂量一致性提供依据。
体液免疫应答评价
体液免疫评价回答疫苗能否诱导针对 SARS-CoV-2 S1 的结合抗体与中和抗体。研究以 20 只雌性 C57BL/6 小鼠随机分为 Ad-S1 组和 PBS 对照组，D0 与 D14 各肌肉注射一次，D14 与 D28 采血分离血清。
结合抗体检测采用 ELISA。96 孔板包被 SARS-CoV-2 S 蛋白（1 μg/mL），血清稀释后加入，依次加入 Spike 抗体（1:2000）与 HRP 标记二抗（1:10000），显色后用 SpectraMax 190 酶标仪在 450 nm 和 630 nm 读数并拟合标准曲线。结果显示，Ad-S1 组在第一次和第二次免疫后均检出 S1 特异性抗体，对照组未检出；D28 稀释滴度（GMT 2297.4）较 D14（GMT 378.9）升高 6.1 倍。该数据表明疫苗可诱导结合抗体，且二次免疫后抗体水平继续上升。
中和抗体检测分别采用 VSV 假病毒系统和活病毒系统。假病毒试验中，血清 56 °C 灭活后梯度稀释，与 200 CCID50 病毒悬液混合，37 °C 孵育 2 h 后接种 HEK293 细胞，培养 96 h 后于倒置显微镜下观察 CPE，以 1:12 为阳性判定界值。活病毒试验中，稀释血清与 SARS-CoV-2 混合孵育后感染 Vero E6 细胞，37 °C 培养 72 h 后于 40 倍镜下观察 CPE 并计算中和滴度，全程在生物安全三级环境中进行。Ad-S1 组 D14 与 D28 活病毒中和滴度分别为 1:24.3 和 1:26.3，假病毒中和滴度分别为 1:28.1 和 1:29.6，D28 假病毒中和 GMT（769.0）较 D14（283.7）升高 2.7 倍。两种方法结果相近，说明免疫血清在体外可有效抑制 SARS-CoV-2 感染，为体液免疫的功能活性提供直接证据。
细胞因子检测与细胞免疫分析
该环节回答疫苗是否诱导细胞免疫以及应答偏向。研究第二次采血后 7 天，用 MSD 多因子检测板测定血清细胞因子。结果显示 IL-6 无明显变化，IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5 和 TNF-α 升高，KC/GRO 降低。IFN-γ 与 IL-12 升高、IL-4 降低提示疫苗诱导 Th1 偏向的 T 细胞应答，IL-5 升高提示 Th2 细胞也参与应答；KC/GRO 降低可能与中性粒细胞趋化减弱、炎症反应受控有关。该数据说明疫苗不仅诱导体液免疫，也激活了以 Th1 为主的细胞免疫，构成对免疫原性的补充支持。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 互补 | 实时荧光定量 PCR、Western blot、间接免疫荧光 | 分别从 mRNA 转录、蛋白分子量、细胞内表达定位三个层面确认 S1 表达，单一项不足以支撑表达结论 |
| 衔接 | 腺病毒滴度测定、动物免疫 | 滴度数据确定免疫剂量，保证组间接种量一致，是免疫结果可比较的前提 |
| 验证 | ELISA、假病毒中和试验、活病毒中和试验 | ELISA 反映抗体结合能力，两种中和试验反映抗感染功能活性，结果相互印证 |
| 补充 | 中和试验、细胞因子检测 | 前者评价体液免疫功能，后者提示细胞免疫偏向，共同支撑免疫原性结论 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 确认重组载体中外源蛋白表达 | 实时荧光定量 PCR、SDS-PAGE 与 Western blot 成像、荧光显微镜 | 转录、蛋白分子量与细胞内定位三类数据互相支撑，降低单一方法假阳性风险 |
| 确定病毒载体免疫剂量 | 梯度稀释、免疫染色、倒置显微镜计数，按公式换算滴度 | 保证动物实验接种量可控，是后续免疫结果可比较的基础 |
| 评价疫苗体液免疫原性 | ELISA 与酶标仪、假病毒中和试验、活病毒中和试验 | 结合抗体与功能中和抗体分别检测，两类数据共同反映体液免疫水平 |
| 分析疫苗免疫应答偏向 | MSD 多因子检测平台 | 多项细胞因子同时检测，有助于判断 Th1/Th2 偏向及炎症相关因子变化 |
需要注意的是，上述组合的适用前提是研究已有明确的目标抗原和可用的载体系统，且检测抗体与目标蛋白匹配。中和试验中活病毒操作需在相应生物安全等级条件下进行，假病毒系统可作为功能评价的补充，但不能完全替代活病毒数据。细胞因子结果受采血时间点影响，需要结合免疫方案统一解读。在类似研究中，若研究目标是评价其他抗原或载体，表达验证和免疫学检测的基本框架可参考，但具体抗体、稀释比例和判定界值需根据自身体系重新确认。
文献信息
Chen K, Shi D, Li C, et al. Adenovirus Vaccine Containing Truncated SARS-CoV-2 Spike Protein S1 Subunit Leads to a Specific Immune Response in Mice. Vaccines (Basel). 2023;11(2):429. PMID: 36851306. DOI: 10.3390/vaccines11020429.