部分 mRNA 疫苗抗原在细胞内表达后难以有效易位至细胞表面，导致 B 细胞和抗原提呈细胞识别不足，抗体反应偏弱。本研究构建模块化疫苗平台（MVP），将抗原胞外域与信号肽、跨膜区及胞质段等模块重组，形成嵌合抗原，并以 mpox 病毒（MPXV）A29、M1R、A35R 等蛋白为模型，系统评价不同模块对细胞表面易位（CST）的促进作用。总体路线是：先在 293T 等细胞中通过流式细胞术定量嵌合抗原表面表达，筛选有效模块；再将候选嵌合抗原包封为 LNP mRNA 免疫小鼠，用 ELISA 检测抗体滴度、用 T 细胞功能实验评价细胞免疫；以 MPXV 为模型开展致死性痘苗病毒攻毒实验，验证保护效果；并将有效模块推广至 VZV gE 与 HPV16 E6、E7 抗原。
流式细胞术承担体外 CST 定量与模块筛选的核心作用，ELISA 与 T 细胞功能实验承担体内免疫原性评价，病毒攻毒实验则承担保护力验证。三类数据共同形成「表面表达—抗体与 T 细胞反应—保护效果」的证据链，其中嵌合抗原表面表达与抗体滴度呈正相关，而 T 细胞反应与表面表达的相关性并不明显。
实验流程
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 模块库构建与嵌合抗原质粒组装 | Golden Gate 组装、Sanger 测序 | 将抗原胞外域与 SP、TM/C 等模块快速重组，确保序列保真 | 嵌合抗原序列、模块组合信息 |
| 体外表面表达筛选 | 流式细胞术（Attune NxT、BD FACSAria III）、FlowJo 分析 | 量化不同模块介导的抗原表面易位强度，筛选有效 CST 模块 | PE 阳性率、PE-high 积分、归一化 PE 积分、CST 评分 |
| mRNA 制备与 LNP 包封 | 体外转录 kit、NanoAssemblr Ignite、RiboGreen 法 | 将嵌合抗原 mRNA 包封为 LNP，用于体内递送 | mRNA 浓度、包封率 |
| 小鼠免疫与体液免疫评价 | 酶联免疫吸附试验（ELISA）、多模式酶标仪 | 检测嵌合抗原诱导的抗体滴度，比较模块效果 | OD450、稀释依赖性 AUC、抗体滴度 |
| T 细胞功能评价 | LEGENDplex 多因子检测、AIM assay、流式细胞术、细胞内细胞因子染色 | 评价 T 细胞活化、细胞因子分泌与 TH1/TH2 偏向 | IFNγ、TNFα、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 浓度，AIM 阳性比例 |
| 致死性病毒攻毒保护评价 | 痘苗病毒（VACV）致死性攻毒模型 | 验证嵌合抗原 LNP mRNA 是否提供更好的保护 | 生存率、体重变化、疾病评分 |
| 平台通用性验证 | 流式细胞术、ELISA、T 细胞功能实验、靶细胞杀伤实验 | 将有效模块应用于 VZV gE、HPV16 E6/E7 等抗原 | 表面表达、抗体滴度、AIM、细胞因子、靶细胞裂解数据 |
关键环节
模块库构建与体外 CST 筛选
研究首先需要解决的是如何系统评价不同 CST 模块将抗原转运至细胞表面的能力。平台从人血浆膜单次跨膜蛋白中提取信号肽（SP）、胞外铰链、跨膜域（TM）和胞质段（C），按膜拓扑分为 I 型和 II 型模块库；I 型库包含 9 个 SP、6 个 TM 和 9 个 C 段构建体，理论上可产生约 500 种组合，II 型库包含 34 个质膜单次跨膜蛋白的 TM/C 模块。嵌合抗原序列通过 Golden Gate 组装，每一个嵌合抗原均经 Sanger 测序确认。流式细胞术在此环节承担定量角色：以 PE 标记抗体进行表面染色，记录 PE 阳性率、PE-high 群平均荧光强度与积分，并将各抗原数据集中的表面表达归一化为 CST 评分，用于横向比较模块强度。该数据直接支持「某些模块可显著提高多种抗原表面表达」的结论，其中 HLA TM/C、FIBCD1、KEL 等模块在多个抗原中表现稳定。
LNP mRNA 制备与体内免疫原性评价
体外筛选出的模块能否在体内转化为更强的免疫反应，需要通过 LNP mRNA 递送和动物免疫实验回答。mRNA 由线性化 DNA 模板体外转录，掺入 N1-甲基-假尿苷，经纯化后与脂质混合，使用 NanoAssemblr Ignite 制备 LNP，并以 RiboGreen 法测定包封率和浓度。小鼠经肌肉注射免疫后，血浆用 ELISA 检测抗原特异性抗体：抗原包被于 384 孔板，血浆四倍系列稀释，加入抗小鼠 IgG 二抗，TMB 显色后于 450 nm 读数，以稀释依赖性 AUC 表示抗体滴度。该数据用于比较天然抗原与嵌合抗原的体液免疫差异，结果显示嵌合 A29 变体抗体滴度比天然 A29 高 2～3 个数量级，M1Re 中 spike、HLA、HLA + EABR 等 TM/C 模块也显著提高抗体反应。
T 细胞功能与 TH1/TH2 偏向评价
抗体反应之外，研究还需评价细胞免疫及免疫应答类型。PBMC 经抗原肽或蛋白刺激后，用 LEGENDplex 多因子检测培养基中细胞因子，或用 AIM assay 与细胞内细胞因子染色结合流式细胞术检测活化标志物和胞内细胞因子。流式抗体面板包括 CD3、CD8a、CD4、CD25、CD69、CD137、OX40 等，用于识别抗原特异性活化 T 细胞。该环节的数据表明，嵌合 A29 与 M1Re 可增强 T 细胞细胞因子分泌，不同 TM/C 模块对 TH1/TH2 平衡的调节方向不同，例如 spike TM/C 偏向 TH1，而 HLA + EABR 与 M1R TM/C 偏向 TH2。需要注意，T 细胞反应与抗原表面表达水平之间未观察到明显相关性，说明仅以表面表达预测 T 细胞反应并不充分。
致死性病毒攻毒保护评价
体外表达与免疫原性数据最终需要保护力证据支持。研究以 MPXV 为模型，小鼠在第 0、7 天肌肉注射 4 μg 编码 A29、M1R 或 A29 + M1R 的 LNP mRNA，第 21 天经鼻接种致死剂量痘苗病毒（Western Reserve 株），随后连续 13 天监测生存率、体重变化与疾病评分。未免疫组和天然 A29 组出现明显体重下降并于攻毒后第 6 天死亡；未修饰 M1R 与 A29 + M1R 组生存率分别为 40% 和 80%；而嵌合抗原组普遍表现出更快的体重恢复、更轻的疾病体征和更高的生存率。该数据证明增强 CST 的嵌合抗原在体内提供更好的保护。
平台通用性验证
为判断模块是否仅适用于 MPXV，研究进一步将有效模块用于 VZV gE 与 HPV16 E6、E7。VZV gE 胞外域与 spike SP、spike TM/C 或 HLA TM/C 重组后，HLA 嵌合体在 293T 细胞表面表达显著提高，并在小鼠中诱导更高抗体滴度与 T 细胞活化标志物。HPV16 E6、E7 与 spike TM/C 重组后，抗体滴度显著高于未修饰版本；spike 与 FIBCD1 嵌合组的 T 细胞活化、细胞因子分泌及对 E6/E7 肽脉冲 B16 靶细胞的杀伤能力均增强。该环节说明同一套 CST 模块可在不同抗原间迁移使用，但模块效果随抗原序列、表达细胞系和时间点变化。
技术协同
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 筛选与验证 | 流式细胞术 → LNP mRNA 免疫与 ELISA | 流式细胞术提供体外表面表达定量，筛选候选模块；ELISA 在体内验证其对抗体滴度的实际影响 |
| 互补评价 | ELISA 与 T 细胞功能实验 | ELISA 反映体液免疫，T 细胞功能实验反映细胞免疫与 TH1/TH2 偏向，二者互补判断免疫应答全貌 |
| 干预与保护验证 | LNP mRNA 免疫 → 痘苗病毒攻毒模型 | 攻毒实验直接检验嵌合抗原设计是否转化为保护效果，是体外与免疫原性数据的最终验证 |
| 通用性延伸 | 流式细胞术、ELISA、T 细胞功能实验、靶细胞杀伤实验 | 将同一套模块用于 VZV、HPV 抗原，验证平台可迁移性，同时暴露模块效果受抗原与细胞背景影响 |
研究组合
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 筛选可提升抗原表面表达的模块 | 流式细胞术 + 表面染色抗体 + FlowJo 类分析软件 | 以 PE 阳性率、PE-high 积分或归一化积分量化表面易位，适合多模块平行比较 |
| 评价嵌合抗原的体液免疫 | LNP mRNA 制备 + ELISA + 多模式酶标仪 | 将体外筛选结果推进到体内抗体滴度，判断模块是否具有免疫原性增益 |
| 评价细胞免疫与应答偏向 | PBMC 分离 + 多因子检测 + 流式细胞术（AIM、胞内细胞因子染色） | 同时获取 T 细胞活化、细胞因子谱与 TH1/TH2 偏向信息 |
| 验证保护效果 | 致死性病毒攻毒模型 + 生存率、体重、疾病评分监测 | 将表面表达与免疫原性数据连接到整体保护力，适合疫苗候选排序 |
在类似研究中，如果研究目标是提升难易位抗原的免疫原性，可以先建立抗原胞外域与模块的重组库，用流式细胞术做第一轮表面表达筛选，再以 LNP mRNA 免疫结合 ELISA 与 T 细胞功能实验做第二轮体内验证，最终用攻毒或保护模型确认。需要注意的是，模块效果并非固定不变，同一模块在不同抗原、不同细胞系和不同时间点的信号强度会有波动；APC 相关细胞系中抗原展示可能不依赖膜锚定，而与肽段降解和提呈事件相关。更稳妥的理解是，流式细胞术提供的是筛选依据，抗体与 T 细胞数据提供的是免疫原性证据，攻毒实验提供的是保护力证据，三者不能互相替代。
文献信息
Fang Z, Monteiro VS, Oh C, et al. A modular vaccine platform for optimized lipid nanoparticle mRNA immunogenicity. Nat Biomed Eng. 2025. PMID: 40855125. DOI: 10.1038/s41551-025-01478-6.