传统空间组学技术通常只能捕获单一组学信息，难以直接揭示表观遗传调控与基因表达之间的机制联系。本文介绍的空间 ATAC-RNA-seq 和空间 CUT&Tag-RNA-seq 技术，通过确定性共条形码（deterministic cobarcoding）在同一组织切片上同时捕获染色质可及性或组蛋白修饰（H3K27me3、H3K27ac、H3K4me3）与转录组信息，实现近单细胞分辨率的空间表观组-转录组共测序。该技术被应用于胚胎和幼年小鼠脑及成人人脑海马组织，通过像素级别的关联分析揭示表观遗传调控在组织发育和细胞动态中的具体作用，为空间多组学研究提供了新的工具。
实验流程总览
| 实验环节 | 仪器技术 | 解决问题 | 产生数据 |
|---|---|---|---|
| 组织切片制备 | 冰冻切片机、多聚赖氨酸包被玻片 | 保持组织形态和 RNA/染色质完整性 | 新鲜冰冻组织切片（7～10 μm） |
| 染色质转座或抗体靶向 | Tn5 转座复合物（ATAC）或 pA-Tn5 与组蛋白修饰抗体（CUT&Tag） | 在组织原位标记开放染色质或特定组蛋白修饰位点 | 带有接头的 DNA 片段（gDNA） |
| mRNA 原位逆转录 | 生物素化 poly-T 接头、逆转录酶 | 捕获组织中的 mRNA 并合成 cDNA | 带有接头的 cDNA |
| 空间条形码引入 | PDMS 微流控芯片（50 或 100 通道） | 为每个组织像素赋予唯一条形码组合 | 二维空间条形码网格（2,500 或 10,000 像素） |
| 文库构建与测序 | 链霉亲和素磁珠分离、PCR 扩增、Agilent Bioanalyzer、Illumina NovaSeq 6000 | 分别构建 gDNA 和 cDNA 文库并进行高通量测序 | ATAC/CUT&Tag 片段文件和 RNA 基因表达矩阵 |
| 生物信息学分析 | Signac、ArchR、Seurat、ST Pipeline 等 | 整合空间表观组和转录组数据，进行聚类、轨迹分析和调控推断 | 聚类、基因活性分数（GAS）、染色质沉默分数（CSS）、peak-to-gene 连接、TF 基序偏差 |
关键环节解析
组织切片制备与固定
该环节的目的是保持组织形态和细胞内分子状态。新鲜冰冻组织切片（7～10 μm）被收集在多聚赖氨酸包被的玻片上，经过 0.2% 甲醛固定以交联蛋白质和核酸，同时加入 RNA 酶抑制剂保护转录本。固定和透化处理需平衡染色质可及性和 RNA 捕获效率，这直接影响后续数据质量。
染色质标记与 mRNA 捕获
对于空间 ATAC-RNA-seq，使用 Tn5 转座复合物在开放染色质区域插入带有通用连接接头的 DNA 适配体；对于空间 CUT&Tag-RNA-seq，则先让组蛋白修饰抗体结合靶位点，再由蛋白 A 偶联的 Tn5 进行靶向切割。同一组织切片随后用生物素化 poly-T 接头结合 mRNA，并通过逆转录合成 cDNA。这一步骤的关键在于两种反应在同一组织上兼容，且互不干扰。
该环节产生带有接头的基因组 DNA 片段和 cDNA，为后续条形码标记和文库构建奠定基础。通过在组织原位完成转座和逆转录，保留了空间信息。
空间条形码引入
为解析空间位置，使用 PDMS 微流控芯片将组织区域划分为网格。第一轮引入 A 条形码（A1～A50 或 A100），第二轮引入垂直方向的 B 条形码，两者通过连接的连接子连接，形成独特的二维条形码组合，从而定义每个组织像素。这种确定性共条形码方法允许生成 2,500 或 10,000 个可分辨像素，像素尺寸可达 20 μm，接近单细胞分辨率。
该环节产生的空间条形码网格是后续解卷积和空间定位的基础，使得每个像素的染色质状态和转录组数据能够与组织解剖位置对应。
文库构建与测序
逆转录后，通过链霉亲和素磁珠分离 cDNA 和基因组 DNA。cDNA 用于构建 RNA 文库，基因组 DNA 用于构建 ATAC 或 CUT&Tag 文库。文库质量通过 Agilent Bioanalyzer 检测，测序在 Illumina NovaSeq 6000 上进行，双端 150 bp 模式。这一环节产生高通量测序数据，用于后续分析。
以 P22 小鼠脑为例，空间 ATAC-RNA-seq 中每个像素的中位独特片段数为 14,284，其中 26% 位于峰内；RNA 部分每个像素平均检测到 1,073 个基因。空间 CUT&Tag（H3K27me3）中，中位片段数为 10,644，12% 位于峰内。这些数据质量指标表明技术能够同时捕获可用的表观组和转录组信息。
生物信息学分析与整合
数据分析包括对 ATAC/CUT&Tag 片段进行比对和峰调用，对 RNA 数据进行基因定量。使用 Signac 和 ArchR 进行聚类，计算基因活性分数（GAS）或染色质沉默分数（CSS），并通过与参考单细胞图谱整合进行细胞类型注释。该环节产生空间分辨的细胞类型分布、轨迹分析和调控元件连接等结果，用于揭示表观遗传调控与基因表达的关系。
技术协同关系
| 关系类型 | 涉及仪器/技术 | 关系说明 |
|---|---|---|
| 流程衔接 | Tn5 转座/pA-Tn5 → 微流控条形码 → 磁珠分离 → 高通量测序 | 组织原位反应与空间条形码结合，使同一组织切片同时产生表观组和转录组数据 |
| 互补验证 | 空间 ATAC / CUT&Tag 数据与公共 scATAC-seq / scCUT&Tag 数据整合 | 与单细胞参考图谱比对，验证细胞类型注释的准确性 |
| 多组学关联 | GAS/CSS 与 RNA 表达的相关性分析 | 在同一像素上关联表观遗传信号与转录水平，识别调控关系 |
| 干预关系 | RNA 与 CUT&Tag 数据联合进行标签转移 | 当表观遗传数据无法清晰区分细胞类型时，利用同一组织的 RNA 数据补充注释 |
研究组合参考
| 研究目标 | 可参考仪器组合 | 组合价值 |
|---|---|---|
| 解析组织发育中表观遗传调控与基因表达的时空动态 | 空间 ATAC-RNA-seq 或空间 CUT&Tag-RNA-seq 结合微流控条形码 | 可在同一组织切片上同时获得染色质状态和转录组信息，用于轨迹分析和基因调控推断 |
| 研究特定组蛋白修饰在组织区域中的功能 | 空间 CUT&Tag-RNA-seq（H3K27me3、H3K27ac、H3K4me3） | 比较不同修饰的分布，分析激活和抑制标记的拮抗关系 |
| 精确注释空间细胞类型 | 空间多组学数据与 scRNA-seq/scATAC-seq 整合 | 利用表观组和转录组的互补信息提高细胞类型解析度，发现单一组学难以区分的亚群 |
需要注意的是，这些技术需要高度优化的组织处理和微流控操作，且不同样本类型可能影响数据质量。在类似研究中，应根据具体研究问题选择合适的修饰标记和空间分辨率。
文献信息
原始文献：Zhang, D. et al. Spatial epigenome-transcriptome co-profiling of mammalian tissues. Nature 616, 113–122 (2023). DOI: 10.1038/s41586-023-05795-1. PMID: 36922587.